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iTRAQ/TMT 標(biāo)記定量蛋白組

iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)技術(shù)是生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的兩種蛋白質(zhì)標(biāo)記定量技術(shù)。iTRAQ/TMT試劑由報告基團(tuán)、平衡基團(tuán)和反應(yīng)基團(tuán)三個基團(tuán)構(gòu)成。反應(yīng)基團(tuán)與肽段相連接使iTRAQ/TMT試劑結(jié)合在肽段上,在一級譜圖中,不同樣本的同一肽段,標(biāo)記后表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。在二級譜圖中,報告基團(tuán)、平衡基團(tuán)和反應(yīng)基團(tuán)之間的鍵斷裂,帶不同同位素標(biāo)簽的同一肽段產(chǎn)生質(zhì)量不同的報告離子,根據(jù)報告離子的豐度可獲得樣本間相同肽段的定量信息。

質(zhì)譜儀

FusionLumos、Q Exactive HF、Oribtrap、Q TOF 6600

技術(shù)優(yōu)勢
定量準(zhǔn)確:基于高效的鑒定軟件和嚴(yán)格的過濾條件,控制鑒定結(jié)果的可靠性
適用性廣:適用于所有物種的各類樣本
檢測通量高:一次可檢測8個樣本
蛋白數(shù)量多:能鑒定高達(dá)10000種蛋白

技術(shù)流程

 

實驗流程

 

信息分析

生信分析總流程

 

標(biāo)準(zhǔn)信息分析
1)蛋白鑒定
2)蛋白功能注釋
3)蛋白亞細(xì)胞定位
4)蛋白定量
5)差異蛋白篩選
6)蛋白互作
個性化分析
1)蛋白組+轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析
2)其余個性化分析

 

 

分析結(jié)果示例

 

 

 

案例分析

案例(1)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞來源的cadherin-2促進(jìn)血管生成,對肺腺癌有預(yù)后意義

本研究選取腺肺癌臨床組織分離的TECA(癌組織分離血管內(nèi)皮細(xì)胞)、PECA(癌旁組織分離血管內(nèi)皮細(xì)胞)及NECA(正常組織分離血管內(nèi)皮細(xì)胞)進(jìn)行iTRAQ蛋白組學(xué)分析和實驗驗證,發(fā)現(xiàn)血管蛋白Cadherin-2(CDH2)在肺癌組織和細(xì)胞中顯著上調(diào)。通過結(jié)合過表達(dá)實驗和臨床樣本評估結(jié)果,確認(rèn)CDH2降解及表達(dá)的異質(zhì)性導(dǎo)致了與癌細(xì)胞粘附和細(xì)胞遷移/增殖相關(guān)的不同調(diào)控行為。研究為證實cadherin-2作為腺肺癌臨床診斷新的分子靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)。


1 差異蛋白表達(dá)熱圖和不同樣本組蛋白數(shù)據(jù)的PCA分析

案例(2)WDR74通過RPL5-MDM2-p53通路調(diào)節(jié)黑素瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移

本研究對小鼠黑色素瘤細(xì)胞株和黑色素瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞株進(jìn)行iTRAQ蛋白組學(xué)分析和qPCR、免疫印跡等實驗,發(fā)現(xiàn)并驗證了WDR74能促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展和細(xì)胞增殖,并通過過表達(dá)和敲除實驗等揭示了WDR74對RPL5-MDM2-p53通路的調(diào)控作用。WDR74及其機(jī)制的研究為WDR74作為臨床預(yù)防和治療黑素瘤的候選靶點提供理論依據(jù)。


2 通過iTRAQ檢測到WDR74的電離肽的注釋質(zhì)譜

 

3 WDR74調(diào)控RPL5-MDM2-p53通路機(jī)制圖

案例(3)利用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(TMT)標(biāo)記揭示小鼠附睪脂肪組織中年齡和高脂飲食特異性蛋白質(zhì)組的變化

本研究主要從不同年齡的高脂與低脂小鼠中分離附睪脂肪組織,采用TMT標(biāo)記法探索年齡和高脂飲食對附睪組織中蛋白質(zhì)的變化。揭示出長期高脂飲食顯著改變了55種與免疫應(yīng)答和腎素-血管緊張素系統(tǒng)相關(guān)的蛋白質(zhì),確定了與年齡相關(guān)和高脂肪飲食特異性蛋白質(zhì)組學(xué)特征,突出了精氨酸代謝對年齡增長的響應(yīng),以及支鏈氨基酸代謝對高脂肪喂養(yǎng)的早期響應(yīng)。


4 附睪脂肪蛋白質(zhì)組中飲食和年齡相關(guān)變化比較的實驗設(shè)置和工作流程

[1] Zhuo H, et, al. Tumor endothelial cell-derived cadherin-2 promotes angiogenesis and has prognostic significance for lung adenocarcinoma[J]. Molecular Cancer, 2019, 18:34.

[2] Li Y, et, al. WDR74 modulates melanoma tumorigenesis and metastasis through the RPL5-MDM2-p53 pathway[J]. Oncogene, 2020, 39: 2741-2755.

[3] Plubell D L, Wilmarth P A, Zhao Y , et al. Extended Multiplexing of Tandem Mass Tags (TMT) Labeling Reveals Age and High Fat Diet Specific Proteome Changes in Mouse Epididymal Adipose Tissue[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2017, 16(5):873-890.

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