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       外泌體(exosomes)是由細胞內多泡體與細胞膜融合后,釋放到細胞外基質(zhì)中的一種直徑約 30-120nm 的膜性囊泡。幾乎所有種類(lèi)的細胞都能分泌外泌體,并存在于人體各種體液之中,包括血液、尿液、唾液、乳汁、腦脊髓液等。外泌體含有細胞特異的蛋白、脂質(zhì)和核酸,能作為信號分子傳遞給其他細胞從而改變其他細胞的功能,參與免疫反應、抗原遞呈、腫瘤轉移、心腦血管系統、神經(jīng)系統等生理和病理過(guò)程 。


       外泌體可運載不同種類(lèi)的核酸,如 DNA、mRNA 和 miRNA,rRNA,snoRNA 等,其中 miRNA 受到最多的關(guān)注,由于它在基因表達調控上有著(zhù)重要作用。miRNA 是一類(lèi) 17-24nt 長(cháng)的小的非編碼 RNAs,是一類(lèi)重要的 sRNA(small RNA,sRNA)。miRNA 通過(guò)與 mRNA 的 3’ UTR 或者開(kāi)放閱讀框 ORF 區域結合,能介導基因的轉錄后沉默,與細胞增殖分化、遷移、疾病發(fā)生和疾病進(jìn)展都有關(guān)系。外泌體的脂質(zhì)雙層膜結構,能很好的保護其包被的 miRNA,使其可作為疾病診斷和預后的生物標志物[2],影響腫瘤生長(cháng)、增殖和轉移。


       外泌體smallRNA 測序可以得到不同組織、不同發(fā)育階段、不同疾病狀態(tài)下 sRNA 的表達情況,其中 miRNA、siRNA 以及 piRNA 是研究的熱點(diǎn),也是項目分析的重點(diǎn)。外泌體smallRNA 測序可以找到不同樣本間差異表達的miRNA,也可以鑒定新的miRNA。通過(guò)生信分析得到其靶位點(diǎn)所在基因的 GO 功能注釋以及KEGG pathway 注釋?zhuān)罱K可以得到外泌體 small RNA 在生物體中參與的生命活動(dòng)的一個(gè)清晰的生物信息圖譜。


實(shí)驗方案
       測序策略:Illumina平臺  SE50

       數據量:10M clean reads/樣


技術(shù)優(yōu)勢
       通量高:一次測序得到上千萬(wàn)條序列;
       分辨率高:可以檢測小RNA單個(gè)堿基的差異;
       精準度高:從幾個(gè)到幾十萬(wàn)個(gè)拷貝精確計數;
       可重復性好:深度測序保證了抽樣隨機性,重復性好,無(wú)需重復實(shí)驗;

       檢測范圍廣:既能鑒定已知小RNA,又能發(fā)現新的小RNA。


數據分析
       標準信息分析
(1)按標準流程進(jìn)行數據整理及數據質(zhì)量評估;
(2)樣品間的公共序列和特異序列分析;
(3)小RNA與參考基因組比對分析;
(4)按照優(yōu)先級將小RNA進(jìn)行分類(lèi)注釋
(5)Novel Small RNA預測;
(6)樣本間miRNA差異表達分析;
(7)已知miRNA的家族分析;
(8)已知miRNA差異分析(≥2個(gè)樣本)和聚類(lèi)分析(≥3個(gè)樣本);
(9)已知miRNA和novel miRNA的靶基因預測;
(10)已知miRNA和novel miRNA的靶基因GO注釋和KEGG通路分析;
(11)novel miRNA差異分析(≥2個(gè)樣本)和聚類(lèi)分析(≥3個(gè)樣本);
(12)差異miRNA靶基因預測;

(13)已知miRNA的堿基編輯分析;


       高級信息分析
(1)snoRNA注釋;
(2)piRNA注釋;

(3)mir2disease注釋.


技術(shù)流程




案例分析
       案例(1)卵巢癌細胞通過(guò)基質(zhì)細胞外泌體傳遞的miR21靶向APAF1獲得紫杉醇抗性

       晚期卵巢癌細胞通常會(huì )發(fā)生大網(wǎng)膜脂肪組織處的轉移,但是網(wǎng)膜基質(zhì)細胞來(lái)源的分子對卵巢癌生長(cháng)的影響還未見(jiàn)太多報道。本文通過(guò)二代測序技術(shù)發(fā)現腫瘤相關(guān)的脂肪細胞和成纖維細胞中miR21的表達量明顯高于卵巢癌細胞。通過(guò)功能研究發(fā)現,腫瘤相關(guān)的脂肪細胞和成纖維細胞的miR21可以轉移到卵巢癌細胞中,從而抑制卵巢癌細胞凋亡并通過(guò)結合一個(gè)新發(fā)現的靶mRNA—APAF1賦予其化療抗性。這些數據表明,轉移性卵巢癌細胞的惡性表型可通過(guò)從相鄰網(wǎng)膜基質(zhì)細胞來(lái)源的外泌體遞送miR21來(lái)獲得,抑制基質(zhì)細胞來(lái)源的miR21可能是治療轉移性或復發(fā)性卵巢癌的一個(gè)新策略。



圖1 腫瘤相關(guān)的脂肪細胞分泌的外泌體中miR21表達上調


圖2 卵巢腫瘤組織和腫瘤細胞系中miR21的表達差異情況


       案例(2)外泌體miRNA可用于非小細胞肺癌的早期診斷
       該研究從早期非小細胞肺癌(NSCLC)患者的血漿中分離腫瘤來(lái)源的外泌體。利用miRNA-seq對46個(gè)I期NSCLC患者和42個(gè)健康個(gè)體的外泌體miRNA進(jìn)行分析,以鑒定和驗證腺癌(AC)和鱗狀細胞癌(SCC)的特異性miRNA。與健康個(gè)體相比,AC和SCC患者分別有11個(gè)和6個(gè)miRNA表達水平顯著(zhù)增高,13個(gè)和8個(gè)miRNA表達水平顯著(zhù)降低。不同的腺癌和鱗癌特異性的外泌體miRNA進(jìn)一步被驗證。與以前研究報道一致,miRNA-seq數據證實(shí)了可用于診斷NSCLC和其他癌癥的潛在miRNA,如let-7、miR-21、miR-24和miR-486。結果表明,miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p為AC特異性的,miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b為SCC特異性的。采用AUC值為0.899、0.936和0.911,分別檢測NSCLC、AC和SCC,評估三種組合miRNA組的診斷準確度。這些miRNA在用于早期NSCLC診斷并用于高度敏感的非侵入性生物標志物是非常有希望的。


圖1 鑒定和定量健康個(gè)體、AC患者和SCC患者腫瘤來(lái)源的外泌體



圖2 qPCR驗證miRNA表達的結果

       案例(3)外泌體攜帶的miR-25-3p和miR-92a-3p能夠刺激惡性脂肪肉瘤的發(fā)
       盡管近年來(lái)已發(fā)展出針對脂肪肉瘤(LPS)的聯(lián)合治療方案,但大部分患者對這些療法僅有輕微應答,并且可能導致局部或遠端的腫瘤復發(fā)。早期檢測到腫瘤的復發(fā)或轉移可以通過(guò)早期臨床干預來(lái)改善患者的預后。然而,目前還缺乏有效的生物標志物。該研究使用患者血漿和細胞系作為研究對象,證明了miR-25-3p和miR-92a-3p是由LPS細胞通過(guò)細胞外囊泡分泌的,可用作潛在的疾病診斷生物標志物。miR-25-3p和miR-92a-3p以TLR7 / 8依賴(lài)性方式刺激腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)分泌促炎細胞因子IL-6,這反過(guò)來(lái)促進(jìn)LPS細胞增殖,侵襲與轉移。該研究提供了新的LPS發(fā)展機制,LPS細胞與其微環(huán)境之間的通訊對LPS的發(fā)展具有重要作用。該研究揭示了循環(huán)miRNA可作為疾病診斷以及監測治療效果的生物標志物。


LPS患者樣本中PBV和PB的miRNA表達情況


參考文獻

[1] Au Yeung et al. Exosomal transfer of stroma-derived miR21 confers paclitaxel resistance in ovarian cancer cells through targeting APAF1. Nature Communications, 2016.
[2] Jin et al. Evaluation of tumor-derived exosomal miRNA as potential diagnostic biomarkers for early stage non-small-cell lung cancer using next-generation sequencing. Clinical Cancer Research, 2017.
[3] Casadei et al. Exosome-derived miR-25-3p and miR-92a-3p stimulate liposarcoma progression.Cancer Research, 2017.

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