傳統的高通量測序是對某一組織整體的細胞合集進(jìn)行測序和分析，而某一個(gè)細胞的基因信息則會(huì )被整體覆蓋。隨著(zhù)高通量測序技術(shù)的發(fā)展，人們對基因組與表型之間的關(guān)系認識越來(lái)越深刻，單個(gè)細胞也有可能攜帶重要的信息。

10x單細胞測序是使用10x Genomics平臺，將單細胞懸液中的每個(gè)細胞分別進(jìn)行標記，再通過(guò)逆轉錄和PCR建庫測序，分析單個(gè)細胞的轉錄組信息。單細胞測序可以揭示復雜細胞群體的異質(zhì)性，避免單個(gè)細胞的基因表達信號被群體的平均化所掩蓋。

1、10x單細胞轉錄組測序實(shí)驗方案

測序策略：Illumina平臺PE150

數據量與捕獲的細胞數量相關(guān)，捕獲細胞越多，產(chǎn)生的數據量也越多，具體如下：

2、單細胞轉錄組測序技術(shù)優(yōu)勢

（1）精準分選：利用10x Genomics平臺，實(shí)現真正的單細胞測序；

（2）細胞捕獲率高達65%，可實(shí)現大量單細胞的快速高效標記、測序和分析；

（3）項目周期短，技術(shù)應用范圍廣。

3、送樣建議

細胞樣本

聯(lián)系我們上門(mén)服務(wù)（提前10個(gè)工作日預約）。

血液樣本

抽取5ml人外周血加入到EDTA抗凝管中，分離PBMC后，聯(lián)系我們上門(mén)服務(wù)（提前10個(gè)工作日預約）。

組織樣本

方案一：取新鮮組織進(jìn)行組織解離后，制備為細胞懸液，聯(lián)系我們上門(mén)服務(wù)（提前10個(gè)工作日預約）；

方案二：新鮮組織取黃豆大小（1-2mm3）剪碎后置于保存液（公司提供）中，48h內冰袋運輸到我司。每個(gè)樣本至少準備兩管，一管作為備份。

注意事項：冰袋若從-80℃拿出，需放4℃冰箱2h。

4、技術(shù)流程

5、單細胞轉錄組測序信息分析

1測序數據質(zhì)控和定量

1.1測序序列統計與質(zhì)控

1.2數據定量

1.3多樣本數據合并和定量均一化

1.4最終鑒定細胞表達量矩陣

2細胞亞群分類(lèi)

2.1細胞過(guò)濾

2.2單細胞亞群分類(lèi)

3 Marker基因分析

4差異富集分析

4.1差異基因GO富集性分析

4.2差異基因KEGG富集性分析

5高級分析

5.1已知基因在細胞亞群表達分布及熱圖

5.2細胞分化擬時(shí)序分析

5.3細胞相互作用圖譜

5.4加權基因共表達（WGCNA）分析

5.5蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò )分析

5.6細胞周期鑒定

6、結果展示

圖1 PCA基因熱圖

圖2 單細胞亞群分類(lèi)tSNE圖

圖3 擬時(shí)序軌跡圖

（擬時(shí)序分析（pseudotime），即構建細胞譜系發(fā)育，主要是判斷不同細胞表達量之間的關(guān)系，不同亞群之間表達量過(guò)渡的變化就是一條軌跡，這個(gè)時(shí)間并不是真的時(shí)間，而是一個(gè)虛擬的時(shí)序列，是指細胞與細胞之間的轉化和演替的順序和軌跡。Monocle是我們經(jīng)常用的擬時(shí)序分析工具，通過(guò)R語(yǔ)言讀取seurat對象后可進(jìn)行數據分析，基于某些Marker基因表達模式，進(jìn)而描繪細胞在隨時(shí)間發(fā)育過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化。）

圖4 擬時(shí)序變化相關(guān)基因（Top10\ Top50）表達分布圖\熱圖

7、單細胞轉錄組測序案例分析 

Nature Immunology狼瘡性腎炎患者的腎臟免疫細胞組成單細胞測序分析

圖5 細胞亞型聚類(lèi)圖

通過(guò)對LN患者和健康個(gè)體的腎臟、血液和尿液樣本進(jìn)行單細胞轉錄組測序分析，結果顯示，血液與腎臟中檢測到的細胞分子特征存在相似性和差異性，而尿液與腎臟中白細胞亞群的分子活化狀態(tài)高度相關(guān)，有望作為腎臟活檢的代替物。

使用低分辨率聚類(lèi)將所取腎臟細胞分為了10個(gè)集群，基于譜系標記基因和其他基因上調，將集群標記為髓細胞（C4, C6）、T/NK細胞（C0, C1, C2, C5）、B細胞（C3, C8）、分裂細胞（C9）和腎上皮細胞（C7）。接下來(lái)，將每個(gè)譜系的細胞分別進(jìn)行聚類(lèi)，一共確定了21個(gè)免疫細胞集群和一個(gè)上皮細胞集群（圖2）。

研究利用單細胞轉錄組學(xué)研究從LN患者和活體供體對照中獲得的腎臟樣本，揭示了LN腎臟免疫群體的復雜性，識別了髓細胞、NK細胞、T細胞和B細胞等多種疾病特異性亞群。研究發(fā)現：大量的分裂細胞和NK細胞，表明IFNγ和細胞溶解分子的主要來(lái)源，CD8⁺  T細胞中衰竭標記的少量表達表明了LN中的細胞毒性。浸潤白細胞的干擾素反應特征與血液中的相同特征相關(guān)，趨化因子受體CXCR4和CX3CR1在腎臟免疫細胞中頻繁表達，提示它們可能是潛在的治療靶點(diǎn)，尿液免疫細胞基因表達與相應的腎臟白細胞高度相關(guān)。

參考文獻 ：

[1] Arazi A., Rao, D. A., et al. (2019). The immune cell landscape in kidneys of patients with lupus nephritis. Nature Immunology.