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        免疫組庫(Immune Repertoire,IR)是指某個(gè)個(gè)體在任何特定時(shí)間點(diǎn)其循環(huán)系統中所有功能多樣性B淋巴細胞和T淋巴細胞的總和。T細胞和B細胞分別介導機體的細胞免疫和體液免疫應答,分別通過(guò)其表面的T細胞受體(TCR)和 B細胞受體(BCR)來(lái)識別和結合抗原,進(jìn)而發(fā)揮功能清除病原體或體內腫瘤細胞。


        免疫組庫高通量測序是通過(guò)多重PCR或SMART RACE法擴增TCR/BCR全長(cháng)或CDR3區序列(主要是TCR的β鏈或BCR的重鏈),再結合高通量測序技術(shù),對機體免疫組庫的多樣性及每種 T、B細胞克隆的獨特性序列組成和變化進(jìn)行分析,從而全面評估機體的免疫狀態(tài),明確疾病與T、B細胞克隆組成及變化之間的關(guān)系。隨著(zhù)免疫組庫高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟,基于免疫組庫多樣性變化特點(diǎn)的生物標志物發(fā)現、腫瘤等疾病療效預測、疾病的易感性和抵抗性、感染性疾病及疫苗研究等方面都取得了重要進(jìn)展。


實(shí)驗方案
        測序策略: Illumina平臺  PE150

        數據量:1G raw date/樣


樣本要求
        (1)分選的T或B細胞:建議細胞數103-107個(gè),離心后保存于1ml Trizol中并混勻,低溫保存運輸。
        (2)外周血單個(gè)核細胞(PBMC):建議細胞數103-107個(gè),離心后保存于1ml Trizol中并混勻,低溫保存運輸。
        (3)新鮮全血:采集外周血于EDTA抗凝管內,混勻后取 250μl,保存于750μl Trizol LS并混勻,低溫保存運輸。
        (4)組織:取50~100mg組織,保存于1ml Trizol中,低溫保存運輸。

        (5) 如果客戶(hù)自提 RNA,建議最好用進(jìn)口試劑或試劑盒提取,最后溶于無(wú)RNA酶的水中。如果是分離的PBMC,RNA濃度大于50ng/μL,總量大于500ng。如果用組織提 RNA,濃度>500ng/μL,總量>5μg。 


技術(shù)優(yōu)勢
        (1)擁有自主發(fā)明專(zhuān)利的UMI標記與校正算法(發(fā)明專(zhuān)利號:201810618023.7),對PCR擴增與測序過(guò)程引入的錯誤與偏倚進(jìn)行有效糾正,極大提高分析結果的準確度。
        (2)采用當前免疫組庫擴增最有優(yōu)勢的5' RACE法,保證結果的可靠性和后期研究的方便性;
        (3)針對微量細胞樣本(>100個(gè)),可以采用微量建庫技術(shù),大大提高建庫成功率;
        (4)由武漢大學(xué)、中山大學(xué)、南方醫科大學(xué)以及美國斯坦福大學(xué)研究人員組成的專(zhuān)業(yè)的研究和分析團隊,保證研究結果的可信度和可重復性;

        (5)運用國際認可的專(zhuān)業(yè)的免疫組庫分析模塊,并結合我們自己獨有的生物信息分析算法,所提供的標準化的分析流程即可滿(mǎn)足科研或臨床所需。另外我們還可提供數據的深度分析服務(wù)(需另收費).


數據分析
        (1)測序數據質(zhì)量評估
        (2)克隆的鑒定與計數
        (3)不同V/D/J基因的計數、頻率和頻率檢驗
        (4)不同V/D/J基因組合的計數、頻率和頻率檢驗
        (5)有顯著(zhù)差異的克隆型頻率
        (6)CDR3長(cháng)度分布
        (7)CDR3氨基酸與核苷酸序列的克隆計數、頻率和有關(guān)分析
        (8)樣本間CDR3氨基酸序列的相關(guān)性、相似性和多樣性評估

        (9)樣本間共有克隆分析


技術(shù)流程

        RNA提取和質(zhì)檢-SMART RACE法擴增-文庫構建-上機測序-標準信息分析-高級信息分析


案例分析
        案例(1)免疫組庫測序揭示肝癌組織TCR多樣性及其意義(由華銀高通量完成)

        T淋巴細胞通過(guò)特異性T細胞受體(TCR)識別抗原肽,在人類(lèi)適應性免疫應答中扮演著(zhù)重要角色。TCR多樣性與宿主免疫反應及腫瘤預后密切相關(guān)。盡管腫瘤浸潤性T淋巴細胞對腫瘤預后有一定的影響,但很少有研究對乙型肝炎病毒(HBV)相關(guān)肝細胞癌(HCC)中的腫瘤組織和非腫瘤組織中的TCR多樣性進(jìn)行詳細地特性描述。本研究對來(lái)自48位HBV相關(guān)HCC患者的肝癌腫瘤組織進(jìn)行免疫組庫測序。與癌旁組織相比,腫瘤組織CDR3氨基酸(aa)克隆型具有顯著(zhù)較高的平均數(2259 vs.1324,p<0.001),TCR多樣性顯著(zhù)升高(Gini協(xié)同系數,p<0.001;Simpson指數,p<0.01;Shannon熵,p<0.001)。對中央Morisita-Horn相似指數(MHSI)的分析顯示,在腫瘤組織與癌旁組織之間TCR庫相似性較弱。本研究在肝癌患者腫瘤中觀(guān)察到T淋巴細胞具有廣泛的異質(zhì)性,以及在相鄰癌旁組織中有較高的HEC。腫瘤組織和癌旁組織中差異化T細胞庫顯示了乙肝相關(guān)性肝癌患者體內獨特的T細胞免疫微環(huán)境。 



圖1 腫瘤及癌旁組織中Vβ和Jβ基因片段使用頻率熱圖


圖2 CDR3 aa克隆類(lèi)型多樣性的分析


        案例(2)大規模t細胞受體測序闡明CD8+淋巴細胞在拉斯穆森腦炎中的致病機理

        拉斯穆森腦炎(Rasmussen encephalitis, RE)是一種罕見(jiàn)的兒科癲癇疾病伴隨有半腦炎癥和進(jìn)行性神經(jīng)系統缺陷。為了闡明RE的免疫反應過(guò)程,德國明斯克大學(xué)神經(jīng)學(xué)研究所對RE患者的22例血液,2例腦脊液,和5例腦組織切片樣本還有兒科樣本參照進(jìn)行T細胞受體(TCR)測序。RE患者樣本表現為外周CD8+T細胞的擴散程度與疾病的嚴重程度相關(guān)。此外,在CNS中,RE是唯一的具有T細胞擴散的兒科癲癇疾病。同時(shí)提示在RE中,外周擴散的CD8+淋巴細胞的抗原特異性會(huì )侵害CNS,可通過(guò)限制其進(jìn)入CNS來(lái)改善。 


圖1RE患者的TCR組庫嚴重受限制


圖2 RE患者特異性的克隆中CDR3區和Vβ基因的長(cháng)度分布
            

圖3 中樞神經(jīng)系統干細胞移植前后TCR組庫的情況及不同樣本間共享的克隆類(lèi)型

        案例(3)個(gè)體遺傳差異導致獨特的淋巴細胞受體和抗原細胞

        適應性免疫系統的保護機體的能力是需要不同的淋巴細胞抗原受體完成的。然而個(gè)體差異基因和后天因素導致的差異和影響還沒(méi)有被完全闡釋。斯坦福大學(xué)醫學(xué)院通過(guò)對5對同卵雙生雙胞胎的B、CD4+ T和CD8+ T淋巴細胞進(jìn)行分析,來(lái)量化遺傳因素在V(D)J重組過(guò)程和胸腺選擇中的影響。選取PBMC進(jìn)行RNA提取后利用反轉錄獲得目的片段并構建免疫組文庫,使用Miseq進(jìn)行2x300 bp測序,最后分析免疫組庫的差異性。



圖1 遺傳性因素影響的未成熟細胞的基因使用分析圖


圖2 未成熟細胞和記憶細胞的CDR3區域特征遺傳傾向性

參考文獻
[1] Chen et al. High-throughput T cell receptor sequencing reveals distinct repertoires between tumor and adjacent non-tumor tissues in HBV-associated HCC. OncoImmunology, 2016.   
[2] Schneider-Hohendorf et al. CD8+ T-cell pathogenicity in Rasmussen encephalitis elucidated by large-scale T-cell receptor sequencing. Nature Communications, 2016.                 
[3] Rubelt et al. Individual heritable differences result in unique cell lymphocyte receptor repertoires of na?ve and antigen-experienced cells. Nature Communications, 2016.

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