傳統的高通量測序是對某一組織整體的細胞合集進(jìn)行測序和分析，而某一個(gè)細胞的基因信息則會(huì )被整體覆蓋。2009年首個(gè)單細胞轉錄組測序技術(shù)問(wèn)世，開(kāi)啟了單細胞組學(xué)時(shí)代，在2013年單細胞測序技術(shù)被Nature Methods評為年度技術(shù)。單細胞測序技術(shù)經(jīng)過(guò)十余年發(fā)展，各類(lèi)單細胞測序技術(shù)平臺也如雨后春筍般出現，極大地推動(dòng)生物醫學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)研究，幫助科研人員克服了稀有生物樣本以及生物樣本內生異質(zhì)性等重大挑戰。

DNBelab C4 基于液滴微流控原理，實(shí)現單細胞的捕獲和標記，使用DNBSEQ建庫技術(shù)構建專(zhuān)有文庫，采用DNBSEQ T7系統獲得測序數據，并使用配套的分析軟件進(jìn)行數據分析與可視化，在單細胞層面進(jìn)行基因表達、細胞注釋和異質(zhì)化研究。

1、測序策略

測序策略：PE100

測序深度：推薦平均50k reads/cell

測序數據量：100~120G/樣本

2、送樣建議

（1）細胞：大于1*10⁶個(gè)細胞；

（2）組織解離的細胞：大于1*10⁶個(gè)細胞；

（3）血液：大于3 mL；

（4）PBMC：大于1*10⁶個(gè)細胞；

（5）組織：大于黃豆粒大??；

（6）細胞活性大于80%。

3、技術(shù)優(yōu)勢

（1）便攜，操作簡(jiǎn)單：重量220g，無(wú)需電源，負壓驅動(dòng)的液滴生成系統，有效地簡(jiǎn)化液滴捕獲過(guò)程。

（2）雙磁珠高效捕獲：采用自主設計的捕獲磁珠，有效提高細胞捕獲效率以及獲取下?lián)艿耐暾畔ⅰ?/span>

（3）低雙胞率，基因檢測能力更穩定：雙胞率低于8%，每個(gè)細胞平均基因數在1000~2000。

（4）數據高保真，性?xún)r(jià)比高：搭配國產(chǎn)超高通量DNBseq-T7測序平臺，既保證測序數據準確性，也降低測序成本。

4、數據分析

4.1 標準信息分析

（1）測序數據統計與評估

a. 各個(gè)樣本測序數據基本質(zhì)控（reads數、測序飽和度等）

b. 各個(gè)樣本數據比對（細胞數目統計、reads基因組比對率等）

c. 多樣本數據合并（基因表達定量）

（2）單細胞亞群分類(lèi)與分類(lèi)結果可視化

a. 細胞過(guò)濾

b. 單細胞亞群分類(lèi)（各亞群?jiǎn)蝹€(gè)細胞基因中位數、各樣本在各亞群數目統計）

c. 分類(lèi)結果可視化（聚類(lèi)分析可視化（tSNE圖））

（3）亞群上調表達基因分析

a. 上調表達基因篩選

b. 上調表達基因基因GO功能富集分析 

c. 上調表達基因KEGG功能富集分析 

（4）標記基因篩選

a. 標記基因篩選（標記基因在各亞群平均表達量、標記基因聚類(lèi)熱圖）

b. 各標記基因在群體中的表達分布（標記基因tSNE圖）

4.2 高級分析 

（1）已知表達基因（分子markers或表面標記物）在各亞群表達分布圖及熱圖（甲方提供基因標準名稱(chēng)）

（2）細胞軌跡分析

（3）加權基因共表達網(wǎng)絡(luò )（WGCNA）

（4）差異表達基因TF編碼能力預測

（5）差異表達基因蛋白互作分析

（6）基因相關(guān)性網(wǎng)絡(luò )分析

（7）細胞周期鑒定分析

5、技術(shù)流程

6、案例分析

案例（1） 非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物食蟹猴的單細胞轉錄組圖譜

研究團隊對食蟹猴45個(gè)組織約114萬(wàn)個(gè)細胞進(jìn)行單細胞測序分析，獲得非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物全身器官細胞圖譜（圖1）?；谠搱D譜構建了126種病毒易感細胞類(lèi)型的病毒數據庫，可以通過(guò)它快速查詢(xún)病毒最有可能侵染的細胞類(lèi)型，同時(shí)看到該細胞類(lèi)型可能分布的器官。該圖譜還可用于物種進(jìn)化、人類(lèi)疾病以及藥物評價(jià)和篩選相關(guān)的研究，為生物醫學(xué)的發(fā)展提供基礎性的資源和工具，為疾病診療、靶向藥物開(kāi)發(fā)提供助力，為人類(lèi)更好地探究生命的進(jìn)化提供可能。

圖1 食蟹猴全身器官圖譜

案例（2） 人類(lèi)多能性干細胞轉化為8細胞階段全能性胚胎樣細胞

研究團隊通過(guò)系統性的篩選，首次建立了體外全能性的8細胞期胚胎樣細胞（8CLC）的誘導和富集方法?；?/span>DNBelab C4平臺，對8CLC誘導過(guò)程的細胞樣本進(jìn)行了單細胞轉錄組（scRNA-seq）和染色質(zhì)可及性（scATAC-seq）測序，詳細分析了8CLC群體的特征，并在多個(gè)誘導時(shí)間點(diǎn)描繪了8CLC群體的特征，并在多個(gè)誘導時(shí)間點(diǎn)描繪了8CLC誘導過(guò)程中轉錄組和染色質(zhì)開(kāi)放性的動(dòng)態(tài)變化，為研究人類(lèi)8細胞期的合子基因組激活和發(fā)育調控提供了重要的平臺和資源，將拓展我們對人類(lèi)早期胚胎發(fā)育的有限認知。 

案例2 圖1 人胚胎干細胞圖譜

參考文獻：

[1]Han L，et al. Cell transcriptomic atlas of the non-human primateMacaca fascicularis[J]. Nature，2022

[2]Mazid, M.A., et al.Rolling back of human pluripotent stem cells to an 8-cell embryo-like stage[J]. Nature，2022