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外顯子組測序


外顯子組測序是指利用高效的序列捕獲技術(shù)將基因組中的外顯子區域捕獲后進(jìn)行高通量測序的方法。在人類(lèi)基因中大約有180,000個(gè)外顯子,雖然外顯子組僅占人類(lèi)基因組的1%(約30MB),但是約85%的致病突變發(fā)生在外顯子組區域。外顯子組測序主要用于識別和研究與疾病、種群進(jìn)化相關(guān)的編碼區及UTR區域內的結構變異。結合大量的公共數據庫提供的外顯子數據,能夠更好地解釋所得變異結構之間的關(guān)聯(lián)和致病機理。相比傳統方法,外顯子組測序能夠更經(jīng)濟高效的檢測外顯子區域的變異情況,以此來(lái)為臨床診斷和個(gè)體化用藥服務(wù)。外顯子組測序目前已被廣泛的應用于各種癌癥、單基因病、復雜疾病和罕見(jiàn)遺傳病等研究中。

1、實(shí)驗方案

   捕獲平臺:Agilent SureSelect Human All Exon V6(最新捕獲試劑盒)

          測序策略:Illumina NextSeq 500或HiSeq 3000 PE150

          數據量:推薦100×以上的深度測序,約10G clean data

2、技術(shù)優(yōu)勢

(1)高覆蓋度:同等費用下獲得更高深度測序,SNP檢出率99%;

(2)更高通量:適合大樣本量的研究;

(3)經(jīng)濟高效:相比于全基因組重測序,更加經(jīng)濟、高效;

(4)周期短:加快文章發(fā)表與加速臨床應用。

3、數據分析

3.1 標準信息分析

1)按標準流程進(jìn)行數據整理及數據質(zhì)量評估;

2)與參考序列進(jìn)行比對、統計測序深度及覆蓋度;

3SNPInDel變異信息檢測;

4SNPInDel變異所在基因的功能注釋?zhuān)?/span>GO、Pathway);

5CNV檢測和注釋分析;

6)變異基因保守性預測及致病性分析(SIFT、Polyphen-2、GERP);

3.2 高級信息分析

1)癌基因/抑癌基因/易感基因篩查;

2)高頻突變基因統計及通路富集分析;

3NMF突變特征及突變頻率分析;

4)已知驅動(dòng)基因篩選;

5)基因組變異Circos圖展示。

4、捕獲平臺介紹

Agilent SureSelect Human All Exon V5 特點(diǎn)如下:

(1) 捕獲范圍為50Mb,包括21,522條基因的357,999個(gè)外顯子區域;

(2) 根據CCDS、RefSeq、GENECODE、miRNABase、TCGAUCSC數據庫設計探針,可有效獲得外顯子區及其周邊區域的變異信息。

(3)周期短,僅需1.5天,測序樣品便可準備就緒。

5、技術(shù)流程

6、案例分析

案例(1)外顯子組測序揭示結直腸癌耐藥新機制

       該研究通過(guò)對129個(gè)結直腸癌小鼠進(jìn)行外顯子測序以及拷貝數變異分析,對55個(gè)人類(lèi)腫瘤樣本進(jìn)行目標區域測序,鑒別出了晚期大腸癌中與耐藥和藥物敏感性相關(guān)的6個(gè)基因的新突變, ERBB2,EGFR,FGFR1,PDGFRA,MAP2K1和IRS2,并揭示出了對西妥昔單治療抗產(chǎn)生耐藥的新機制。這項研究證實(shí)替身可為在人類(lèi)癌癥中評估靶向療法及將這些反應與潛在基因組學(xué)關(guān)聯(lián)起來(lái)提供一種系統的途徑。在替身中取得成功的療法或許可以指導個(gè)體患者的新療法及幫助藥物開(kāi)發(fā)。

圖1 不同體細胞突變對西妥昔單抗治療腫瘤的增長(cháng)的影響


案例(2)遺傳及化學(xué)誘導的KRAS驅動(dòng)的肺癌基因突變全景圖

對非小細胞肺癌模型的小鼠進(jìn)行外顯子測序。KrasLA2誘發(fā)的肺癌比致癌物質(zhì)誘發(fā)的肺癌有顯著(zhù)水平的非整倍體以及拷貝數變異(CNV),這表明化學(xué)物質(zhì)誘導的腫瘤與轉基因模型擁有不一樣的腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。

1遺傳和化學(xué)誘導肺癌樣本的拷貝數情況

2 發(fā)生在致癌物誘導腫瘤中的驅動(dòng)SNV


案例(3)外顯子組測序發(fā)現皮膚基底細胞癌的新的驅動(dòng)基因和發(fā)展路經(jīng)

皮膚基底細胞癌(BCC)是最常見(jiàn)的一種癌癥,90%的人都存在發(fā)病風(fēng)險,尤其是年齡大和紫外線(xiàn)照射多的人。研究人員測序了236名患者的293個(gè)皮膚基底細胞癌(BCC)的腫瘤樣本,并將測序結果與患者健康細胞的遺傳學(xué)圖譜進(jìn)行比較,發(fā)現了MYCN、PTPN14LATS1都是BCC的驅動(dòng)基因。進(jìn)一步研究表明,這些癌癥驅動(dòng)子也存在于Gorlin綜合征中,這可能就是Gorlin綜合征患者更容易患BCC的原因。

圖1 BCC的突變全景圖



參考文獻

[1] Bertotti et al. The genomic landscape of response to EGFR blockade in colorectal cancer. Nature, 2015.

[2] Westcott et al. The mutational landscapes of genetic and chemical models of Kras-driven lung cancer. Nature, 2015.

       [3] Bonilla et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nat Genet, 2016.

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