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       長(cháng)鏈非編碼 RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一類(lèi)長(cháng)度在200nt以上且不編碼蛋白質(zhì)的RNA,以帶polyA尾和不帶polyA尾兩種形式廣泛存在于各種生物體內,參與細胞內多種過(guò)程調控,具有跨物種的低保守性,組織特異性表達和豐度低等特點(diǎn)。


       近年來(lái)的研究表明,lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉錄激活、轉錄干擾和核內運輸等多種重要的調控過(guò)程,但絕大部分lncRNA的功能目前仍不清楚。應用高通量測序技術(shù),研究人員能夠快速獲得與疾病或者特定生物學(xué)過(guò)程相關(guān)的lncRNA 并進(jìn)行深入研究。

實(shí)驗方案
     測序策略:Illumina 平臺 PE150
     數據量:12G clean data

技術(shù)優(yōu)勢
       (1)任意物種檢測:相對傳統芯片而言,無(wú)需預先設計特異性探針,因此無(wú)需了解物種基因或基因組信息,能夠直接對任何物種進(jìn)行最全面的轉錄組分析;
       (2)分辨率高:可以檢測轉錄本中單堿基的差異;
       (3)檢測范圍廣:從幾個(gè)到數十萬(wàn)個(gè)拷貝精確計數,可同時(shí)鑒定正常和稀有的轉錄本;
       (4)信息分析廣:可以做基因差異表達分析、可變剪切、融合基因分析;新轉錄本預測及注釋。

數據分析
       標準信息分析
       (1)數據過(guò)濾及質(zhì)量評估
       (2)核糖體RNA去除率計算
       (3)比對參考基因組及統計
       (4)基因表達水平分析
       (5)基因表達差異及聚類(lèi)分析
       (6)差異基因KEGG生物通路富集分析(僅限于模式物種)
       (7)差異基因GO功能富集分析(僅限于模式物種)
       (8)已知mRNA表達量分析
       (9)已知mRNA差異表達及聚類(lèi)分析
       (10)已知lncRNA表達量分析
       (11)已知lncRNA差異表達及聚類(lèi)分析
       (12)預測新lncRNA
       (13)新lncRNA鑒定和表達量分析
       (14)新lncRNA差異表達及聚類(lèi)分析
       (15)新lncRNA家族分析
       (16)SNP和InDel檢測與注釋
       (17)生物學(xué)重復樣品間相關(guān)性分析
       (18)蛋白互作網(wǎng)絡(luò )分析
       (19)基因融合
       (20)主成份分析(PCA)
       (21)特征性差異表達基因分析
       (22)lncRNA保守性分析
       (23)可變剪切
       高級分析
       (1)已知mRNA-lncRNA共表達網(wǎng)絡(luò )構建
       (2)基因結構優(yōu)化及優(yōu)化基因的表達值計算 
       (3)eQTL分析

技術(shù)流程


案例分析
       案例(1)瘦豬和肥胖豬組織中lncRNA的表達水平不同

       該研究對豬的兩個(gè)品種陸川和杜洛克的肝臟、肌肉和脂肪組織分別進(jìn)行了lncRNA測序,共鑒定出4868個(gè)lncRNA轉錄本,其中3235個(gè)為新轉錄本,而且lncRNA和mRNA的表達模式是組織特異性的。脂肪組織中差異表達的lncRNA具有794個(gè)潛在的靶基因,這些靶基因富集到脂肪細胞因子信號通路、PI3k-Akt信號通路和鈣離子信號通路。此外,差異表達的lncRNA位于13個(gè)脂肪相關(guān)的數量性狀位點(diǎn),其中包括65個(gè)QTL_ID。接著(zhù),分析了同一QTL_ID中的lncRNA和mRNA,并通過(guò)qPCR證實(shí)了其在兩個(gè)QTL_ID中的共表達。該研究為兩個(gè)豬品種脂肪代謝差異的分子機理提供了新的觀(guān)點(diǎn),為進(jìn)一步研究lncRNA在肥胖發(fā)育中的調控作用奠定了重要基礎。


圖1 組織中lncRNA和mRNA的差異表達


圖2 lncRNA和mRNA差異表達的熱圖


       案例(2)長(cháng)非編碼RNA控制造血干細胞功能
       造血干細胞(hematopoietic stem cell,HSC)具有獨特的基因表達程序,能夠自我更新和分化成各類(lèi)成熟血細胞。長(cháng)非編碼RNA(lncRNA)已成為基因表達和細胞命運決定的重要調節因子,盡管它們在HSC中的功能尚不清楚。該研究對純化的HSC進(jìn)行lncRNA測序,鑒定出323個(gè)未注釋的lncRNA。比較這些lncRNA在差異譜系中的表達顯示159個(gè)lncRNA富集于HSC,其中一些可能是是HSC特異性的(LncHSC)。這些lncRNA基因與編碼蛋白基因具有相似的表觀(guān)遺傳學(xué)特征,如通過(guò)DNA甲基化調節表達。敲低兩種LncHSC對HSC自我更新和譜系定型產(chǎn)生了的不同影響。該研究結果表明,lncRNA在HSC調控中起重要作用,為HSC調控的遺傳回路提供了一個(gè)新的思路。


圖1 HSC特異的lncRNA的鑒定


參考文獻
[1] Yu et al. Comparative analyses of long non-coding RNA in lean and obese pig. Oncotarget, 2017.
[2] Luo et al. Long non-coding RNAs control hematopoietic stem cell function. Cell Stem Cell, 2015.
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