Exosomes作為活細胞分泌的含有RNA和蛋白質(zhì)的微囊，大小為30-100nm，廣泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等多種體液中。最新研究表明，體液中exosomal RNA（特別是miRNA、lncRNA和circRNA）在不同的疾病模型中存在明顯的表達差異。同時(shí)，這些分子被exosomes的脂膜所包裹和保護，能保持其原有穩定性和 生物學(xué)功能，有望成為液體活檢的重要分子標志物。
環(huán)狀RNA（circular RNA）是最近發(fā)現的一類(lèi)特殊的非編碼RNA，它大量存在于真核細胞胞質(zhì)內，是mRNA在剪接的過(guò)程中，上游exon的5’端與下游exon的3’端剪接到一起，從而形成的首尾相接的環(huán)狀RNA分子。
近年研究發(fā)現，高等動(dòng)物中環(huán)狀RNA的種類(lèi)和含量遠遠超過(guò)預期。circRNA具有很多重要的調控功能，例如，circRNA可以作為競爭性?xún)仍碦NA（competing endogenous RNA，ceRNA）結合胞內miRNA，阻斷miRNA對其靶基因的抑制作用。除此以外，circRNA也具有調控其他類(lèi)型RNA、調節蛋白質(zhì)活性等功能。circRNA在不同物種中具有保守性和組織表達特異性，且circRNA對RNase不敏感，因此它比線(xiàn)性RNA更為穩定，所以circRNA在疾病新型診斷與治療方法研發(fā)方面有巨大潛力和重要意義。
實(shí)驗方案
測序平臺和方式：Illumina平臺 PE150
數據量：12G clean data/樣
數據分析
（1）測序質(zhì)量評估：
原始數據過(guò)濾統計
Clean數據堿基組成和質(zhì)量分布圖
（2）比對結果統計：
比對數據Reads數分布統計
（3）circRNA鑒定：
circRNA統計列表
circRNA的長(cháng)度分布
circRNA的來(lái)源分布
已知circRNA的注釋
（4）circRNA的表達水平及差異表達分析：
circRNA的表達水平分析
circRNA的差異表達結果
兩兩樣本之間的差異表達
樣本間共享和特有circRNA統計分析
（5）circRNA的來(lái)源基因分析：
circRNA來(lái)源基因的GO富集分析
circRNA來(lái)源基因的KEGG富集分析
（6）circRNA與miRNA的結合位點(diǎn)預測分析
技術(shù)流程
案例分析
案例（1）外泌體circRNA可作為腫瘤診斷的生物標志物
研究人員首先分離得到了來(lái)自于MHCC-LM3肝癌細胞的外泌體并且對其進(jìn)行了circRNA-Seq。數據分析結果表明，在細胞和外泌體中分別檢測到了5484個(gè)和6751個(gè)circRNA。研究人員將這些在外泌體中存在的circRNA命名為exo-circRNA。與細胞中的circRNA的表達水平相比，exo-circRNA在外泌體中的含量至少富集了2倍。circRNA同miRNA的結合早有報道，巧合的是miRNA在外泌體中也廣泛存在。研究人員還關(guān)注了miRNA與circRNA的結合對circRNA在外泌體中數量的影響。由于CDR1as circRNA是miR-7的海綿體，研究人員將miR-7引入細胞與外泌體中，借此觀(guān)察CDR1as的表達量。研究人員觀(guān)察到CDR1as表達量在外泌體中大幅下降，卻在細胞中略有上升。該結果表明，circRNA在外泌體中的確會(huì )受到miRNA表達量的影響和調控。
circRNA在外泌體中受到miRNA表達的調控
案例（2）KRAS突變細胞分泌的外泌體中環(huán)狀RNA的表達情況
研究者用三種同源KRAS突變結腸癌細胞系建立了環(huán)狀RNA文庫，每種細胞系設有兩個(gè)生物學(xué)重復，且不使用RNase R處理。經(jīng)過(guò)一系列檢測和RNase R處理驗證，最終確定在三種目標細胞系中可以識別和量化大量的環(huán)狀RNA，且環(huán)狀RNA對RNase R處理具有抗性。接著(zhù)，研究者檢測環(huán)狀RNA的表達水平是否受KRAS調控，比較了三種細胞系中候選RNA的水平。發(fā)現環(huán)狀RNA在KRAS突變細胞中被下調，且環(huán)狀RNA調控在主基因中能獨立出現。為了檢測結腸癌細胞分泌的外泌體中能否檢測到環(huán)狀RNA，研究者還對三種細胞系的外泌體RNA進(jìn)行了RNA-seq分析，并用qRT-PCR對結果加以驗證，每種細胞系設有三個(gè)生物學(xué)重復。結果表明，環(huán)狀RNA具有復雜的外泌體穿梭機制。與KRAS突變型細胞衍生的外泌體相比，野生型中RNA結合蛋白的豐度更高。
qPCR驗證3個(gè)細胞系外泌體中候選circRNA和host gene的表達量
參考文獻
[1] Li et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Research, 2015.
[2] Dou et al. Circular RNAs are down-regulated in KRAS mutant colon cancer cells and can be transferred to exosomes. Scientific Reports, 2016.
