T淋巴細胞（T cell）和B淋巴細胞（B cell）主要負責適應性免疫應答，其抗原識別主要依賴(lài)于T細胞受體（T cell receptor, TCR）和B細胞受體（B cell receptor, BCR），這兩類(lèi)細胞表面分子的共同特點(diǎn)是其多樣性，可以識別多種多樣的抗原分子。BCR的重鏈和TCR β鏈由V、D、J、C四個(gè)基因片段組成，BCR IGL鏈和TCR α鏈由V、J、C三個(gè)基因片段組成，這些基因片段在遺傳過(guò)程中發(fā)生重組、重排，組合成不同的形式，保證了受體多樣性。
傳統免疫組庫研究方式局限性較大，10x Genomics新推出的“單細胞免疫譜分析”利用其微流控芯片制備單細胞體系，選擇5’ 端接頭的通用引物和免疫分子恒定區的巢式引物進(jìn)行V(D)J富集，實(shí)現在單細胞水平，對成對的重鏈和輕鏈（B細胞）或α和β鏈（T細胞）進(jìn)行全長(cháng)測序，為免疫組庫全面、系統的研究提供了高效的技術(shù)平臺，對疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機制研究有重要的意義。
圖1. 10x Genomics單細胞系統
1 技術(shù)原理
10x Genomics單細胞免疫組庫測序是建立在GemCode技術(shù)上的微流體平臺，將帶有條形碼和引物的凝膠珠與單個(gè)細胞包裹在油滴中；接下來(lái)在每個(gè)油滴內，凝膠珠溶解，細胞裂解釋放mRNA，通過(guò)逆轉錄產(chǎn)生用于測序帶條形碼的cDNA。液體油層破壞后，cDNA一分為二，后續同時(shí)進(jìn)行基因表達和免疫組庫文庫構建；其中TCR或者BCR的V(D)J序列通過(guò)設計在TCR或者BCR的C區域的巢式PCR引物進(jìn)行富集。然后使用Illumina測序平臺對文庫進(jìn)行測序檢測，即可一次性獲得大量單細胞的基因表達和免疫組庫數據，實(shí)現在單細胞水平同時(shí)對基因表達和免疫組庫的研究。
圖2. BCR測序技術(shù)流程[1]
2 樣本要求
◆ 樣品類(lèi)型：新鮮人或小鼠細胞懸液、血液（全血、PBMC等）；
◆ 細胞來(lái)源：血液提取、磁珠富集、流式分選、組織解離；
◆ 細胞大小：小于40μm；
◆ 細胞總量：細胞懸液，一個(gè)樣本細胞起始量約1x105個(gè)；
◆ 質(zhì)量要求：細胞活性大于85%，理想濃度為1000個(gè)/μl（500~2000個(gè)/μl）；
◆ 細胞培養基及緩沖液不能含有Ca2+和Mg2+等影響酶活性的物質(zhì)。
3 實(shí)驗流程
利用10x Genomics平臺完成單細胞的分離、反轉錄成cDNA后，選擇不同的研究目的進(jìn)行文庫構建：5’ 基因表達文庫、TCR的V(D)J文庫或和BCR的V(D)J文庫。將cDNA分成2份或3份同時(shí)進(jìn)行TCR/BCR的V(D)J富集、文庫構建、測序和5’ 單細胞轉錄組文庫構建、測序，獲得每個(gè)細胞表達譜和V(D)J全長(cháng)序列，獲得數據進(jìn)行細胞亞群聚類(lèi)、細胞表達特征和標記分子篩選等分析。
圖3. 實(shí)驗流程
表1. 5’ 單細胞表達譜和V(D)J免疫組文庫及測序參數
4 分析內容
測序數據質(zhì)量控制；
比對與注釋：樣本基本信息結果統計，樣本contig注釋信息結果統計，樣本Consensus序列注釋信息結果統計；
Clonotype分型；
特征分析：CDR3特征分析，V/J基因特征分析，V-J Paired特征分析；
多樣本分析：樣本間Clonotype比較，Overlapping Clonotype聚類(lèi)分析，Overlapping Clonotype差異分析。
5結果展示
圖4. 組 Case VGene 核酸長(cháng)度分布圖 圖5. 組 Case VGene 氨基酸長(cháng)度分布圖
（左圖橫坐標為VGENE堿基序列長(cháng)度，右圖橫坐標為VGENE氨基酸序列長(cháng)度，縱坐標為clonotype的頻率，不同顏色表示不同clonotype，彩色表示top10 clonotype，灰色表示除top 10以外的其他clonotype。）
圖6. 樣品 TCR_Sample_1 鏈TRA_TRB V-J paired頻率Circos圖
（V-J paire頻率Circos圖，最外圈弧形表示V、J基因，每個(gè)顏色塊代表一種基因，基因頻率越高，色塊越寬；內部色塊間連接弧線(xiàn)表示V-J paired。）
5 技術(shù)優(yōu)勢
可實(shí)現配對的重鏈和輕鏈（B細胞）或α和β鏈（T細胞）的全長(cháng)測序；
精確到單細胞水平，能獲得大量單細胞的免疫組數據；
大規模單細胞VDJ表達譜測序，單個(gè)細胞成本大大降低；
同時(shí)獲得5’ gene expression的單細胞轉錄組數據，可與免疫組數據聯(lián)合分析
6 案例分享
Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment
發(fā)文期刊：Cell
影響因子： 30.41
了解腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的表型，對于癌癥進(jìn)展和免疫治療反應的研究至關(guān)重要。研究者使用單細胞RNA測序分析了來(lái)自8位原發(fā)性乳腺癌患者的45,000個(gè)免疫細胞，同時(shí)也添加了正常乳腺組織、血液和淋巴結中的免疫細胞作對照。研究者開(kāi)發(fā)了預處理流程SeQC和貝葉斯聚類(lèi)和歸一化方法Biscuit，用來(lái)解決單細胞數據固有的計算難題。研究中觀(guān)察到正常免疫細胞與腫瘤組織中免疫細胞之間有顯著(zhù)相似性，但后者針對腫瘤微環(huán)境出現特異性連續表型擴展。對來(lái)自另外27,000個(gè)T細胞的成對單細胞RNA和T細胞受體（TCR）測序，結果揭示了TCR組合使用對表型多樣性的影響。研究結果支持T細胞連續活化模型，但不符合癌癥中的巨噬細胞極化模型[2]。本研究結果對表征腫瘤浸潤免疫細胞具有重要意義。
圖7 分析路程圖
參考文獻：
1. Yaari, G. and S.H. Kleinstein, Practical guidelines for B-cell receptor repertoire sequencing analysis. Genome medicine, 2015. 7(1): p. 1-14.
2. Azizi, E., et al., Single-cell map of diverse immune phenotypes in the breast tumor microenvironment. Cell, 2018. 174(5): p. 1293-1308. e36.
