環(huán)狀RNA（circular RNA）是近年來(lái)發(fā)現的一類(lèi)特殊的非編碼RNA，它大量存在于真核細胞胞質(zhì)內，是mRNA在剪接的過(guò)程中，上游exon的5’端與下游exon的3’端剪接到一起，從而形成的首尾相接的環(huán)狀分子。
研究發(fā)現，高等動(dòng)物中circRNA的種類(lèi)和含量遠遠超過(guò)預期。circRNA具有很多重要的調控功能，如circRNA可以作為競爭性?xún)仍碦NA（competing endogenous RNA，ceRNA）結合胞內miRNA，阻斷miRNA對其靶基因的抑制作用。除此以外，circRNA也具有調控其他類(lèi)型RNA、調節蛋白質(zhì)活性等功能。circRNA在不同物種中具有保守性和組織表達特異性，且circRNA對RNase不敏感，因此它比線(xiàn)性RNA更為穩定，所以circRNA在疾病新型診斷與治療方法研發(fā)方面有巨大潛力和重要意義。
實(shí)驗方案
測序平臺和方式：Illumina 平臺 PE150
數據量：12G clean data/樣
技術(shù)優(yōu)勢
（1）多物種選擇：可直接對人、大鼠和小鼠樣本進(jìn)行最全面的circRNA分析，亦可發(fā)現新的circRNA（其他物種需特殊評估）；
（2）高精確度：數字化信號，可預測到基因家族中相似基因以及不同可變剪切類(lèi)型產(chǎn)生的circRNA序列信息；
（3）高覆蓋度：新一代高通量測序技術(shù)的高深度覆蓋，可以檢測到低豐度的稀有circRNA。
數據分析
（1）測序質(zhì)量評估：
原始數據過(guò)濾統計
Clean數據堿基組成和質(zhì)量分布圖
（2）比對結果統計：
比對數據Reads數分布統計
（3）circRNA鑒定：
circRNA統計列表
circRNA的長(cháng)度分布
circRNA的來(lái)源分布
已知circRNA的注釋
（4）circRNA的表達水平及差異表達分析：
circRNA的表達水平分析
circRNA的差異表達結果
兩兩樣本之間的差異表達
樣本間共享和特有circRNA統計分析
（5）circRNA的來(lái)源基因分析：
circRNA來(lái)源基因的GO富集分析
circRNA來(lái)源基因的KEGG富集分析
（6）circRNA與miRNA的結合位點(diǎn)預測分析
技術(shù)流程
案例分析
案例（1）環(huán)狀RNA促進(jìn)結腸癌增殖和轉移
研究者對正常組織和腫瘤結腸組織樣本進(jìn)行了circRNA測序，結果發(fā)現大量在腫瘤細胞中特異性升高的circRNA，其中一些circRNA得到了RT-PCR實(shí)驗結果的驗證。研究人員對其中一類(lèi)新的circRNA——circCCDC66的功能進(jìn)行了深入研究。結果表明circCCDC66在息肉和結腸癌中表達水平升高，并且與不良預后相關(guān)。通過(guò)在結直腸癌細胞系中進(jìn)行功能獲得性研究和功能缺失性研究，研究人員證明circCCDC66能夠控制多個(gè)生理過(guò)程，包括細胞增殖、遷移、侵襲和非貼附性生長(cháng)等。進(jìn)一步的研究表明circCCDC66通過(guò)調節一系列癌基因來(lái)發(fā)揮它的功能，并且在異種移植腫瘤模型和原位模型中敲低circCCDC66的表達均能夠抑制腫瘤生長(cháng)和侵襲。
以上發(fā)現表明，環(huán)狀RNA在癌癥發(fā)生和轉移過(guò)程中發(fā)揮癌基因功能。該研究為了解環(huán)狀RNA與癌癥之間的關(guān)系以及尋找新的癌癥治療手段提供了重要參考信息。
圖1 circCCDC66促進(jìn)結腸癌增殖
案例（2）circHIPK3通過(guò)結合miRNA來(lái)調節細胞生長(cháng)
對6個(gè)正常組織和7個(gè)腫瘤組織測序，共鑒定出27296個(gè)circRNA分子，超過(guò)80%的環(huán)狀RNA分子起源于外顯子（exon）區。這些circRNA在正常組織和腫瘤組織中存在表達差異。進(jìn)一步分析發(fā)現一個(gè)來(lái)源于2號外顯子HIPK3的circHIPK3，它存在18個(gè)結合位點(diǎn)能夠與9個(gè)miRNA結合，從而抑制細胞生長(cháng)。
圖1 不同組織circRNA的表達差異
圖2 七個(gè)癌組織和對應正常組織中鑒定的特異性circRNA的數目
圖3 circRNA表達豐度多維圖
參考文獻
[1] Hsiao et al. Noncoding Effects of Circular RNA CCDC66 Promote Colon Cancer Growth and Metastasis. Cancer Research, 2016.
[2] Zheng et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications, 2016.
