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       環(huán)狀RNA(circular RNA)是近年來(lái)發(fā)現的一類(lèi)特殊的非編碼RNA,它大量存在于真核細胞胞質(zhì)內,是mRNA在剪接的過(guò)程中,上游exon的5’端與下游exon的3’端剪接到一起,從而形成的首尾相接的環(huán)狀分子。


       研究發(fā)現,高等動(dòng)物中circRNA的種類(lèi)和含量遠遠超過(guò)預期。circRNA具有很多重要的調控功能,如circRNA可以作為競爭性?xún)仍碦NA(competing endogenous RNA,ceRNA)結合胞內miRNA,阻斷miRNA對其靶基因的抑制作用。除此以外,circRNA也具有調控其他類(lèi)型RNA、調節蛋白質(zhì)活性等功能。circRNA在不同物種中具有保守性和組織表達特異性,且circRNA對RNase不敏感,因此它比線(xiàn)性RNA更為穩定,所以circRNA在疾病新型診斷與治療方法研發(fā)方面有巨大潛力和重要意義。

實(shí)驗方案
       測序平臺和方式:Illumina 平臺   PE150
       數據量:12G clean data/樣

技術(shù)優(yōu)勢
       (1)多物種選擇:可直接對人、大鼠和小鼠樣本進(jìn)行最全面的circRNA分析,亦可發(fā)現新的circRNA(其他物種需特殊評估);
       (2)高精確度:數字化信號,可預測到基因家族中相似基因以及不同可變剪切類(lèi)型產(chǎn)生的circRNA序列信息;
       (3)高覆蓋度:新一代高通量測序技術(shù)的高深度覆蓋,可以檢測到低豐度的稀有circRNA。
   
數據分析
       (1)測序質(zhì)量評估:
              原始數據過(guò)濾統計
              Clean數據堿基組成和質(zhì)量分布圖
       (2)比對結果統計:
              比對數據Reads數分布統計
       (3)circRNA鑒定:
              circRNA統計列表
              circRNA的長(cháng)度分布
              circRNA的來(lái)源分布
              已知circRNA的注釋
       (4)circRNA的表達水平及差異表達分析:
              circRNA的表達水平分析
              circRNA的差異表達結果
              兩兩樣本之間的差異表達
              樣本間共享和特有circRNA統計分析
       (5)circRNA的來(lái)源基因分析:
              circRNA來(lái)源基因的GO富集分析
              circRNA來(lái)源基因的KEGG富集分析
       (6)circRNA與miRNA的結合位點(diǎn)預測分析


技術(shù)流程



案例分析
       案例(1)環(huán)狀RNA促進(jìn)結腸癌增殖和轉移

       研究者對正常組織和腫瘤結腸組織樣本進(jìn)行了circRNA測序,結果發(fā)現大量在腫瘤細胞中特異性升高的circRNA,其中一些circRNA得到了RT-PCR實(shí)驗結果的驗證。研究人員對其中一類(lèi)新的circRNA——circCCDC66的功能進(jìn)行了深入研究。結果表明circCCDC66在息肉和結腸癌中表達水平升高,并且與不良預后相關(guān)。通過(guò)在結直腸癌細胞系中進(jìn)行功能獲得性研究和功能缺失性研究,研究人員證明circCCDC66能夠控制多個(gè)生理過(guò)程,包括細胞增殖、遷移、侵襲和非貼附性生長(cháng)等。進(jìn)一步的研究表明circCCDC66通過(guò)調節一系列癌基因來(lái)發(fā)揮它的功能,并且在異種移植腫瘤模型和原位模型中敲低circCCDC66的表達均能夠抑制腫瘤生長(cháng)和侵襲。


       以上發(fā)現表明,環(huán)狀RNA在癌癥發(fā)生和轉移過(guò)程中發(fā)揮癌基因功能。該研究為了解環(huán)狀RNA與癌癥之間的關(guān)系以及尋找新的癌癥治療手段提供了重要參考信息。 


圖1 circCCDC66促進(jìn)結腸癌增殖

       案例(2)circHIPK3通過(guò)結合miRNA來(lái)調節細胞生長(cháng)
       對6個(gè)正常組織和7個(gè)腫瘤組織測序,共鑒定出27296個(gè)circRNA分子,超過(guò)80%的環(huán)狀RNA分子起源于外顯子(exon)區。這些circRNA在正常組織和腫瘤組織中存在表達差異。進(jìn)一步分析發(fā)現一個(gè)來(lái)源于2號外顯子HIPK3的circHIPK3,它存在18個(gè)結合位點(diǎn)能夠與9個(gè)miRNA結合,從而抑制細胞生長(cháng)。


圖1 不同組織circRNA的表達差異


圖2 七個(gè)癌組織和對應正常組織中鑒定的特異性circRNA的數目


圖3 circRNA表達豐度多維圖

參考文獻
[1] Hsiao et al. Noncoding Effects of Circular RNA CCDC66 Promote Colon Cancer Growth and Metastasis. Cancer Research, 2016.
[2] Zheng et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications, 2016.

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