RNA Immunoprecipitation (RIP) 是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術(shù)，是了解轉錄后調控網(wǎng)絡(luò )動(dòng)態(tài)過(guò)程的有力工具，能更有效地發(fā)現miRNA的調節靶點(diǎn)。RIP-seq技術(shù)使用特異性抗體對RNA結合蛋白或者特殊修飾的RNA進(jìn)行免疫共沉淀后，分離純化RNA，通過(guò)高通量測序和分析，深度解析與目標蛋白相互結合的RNA的區域或種類(lèi)。

應用方向
      (1)驗證RNA與靶蛋白的相互作用
      (2)在全轉錄組范圍內鑒定RNA與RBP的相互作用網(wǎng)絡(luò )
      (3)分析RBP與miRNA、lncRNA等非編碼RNA的相互作用

技術(shù)優(yōu)勢
      （1）全轉錄組覆蓋：與RIP芯片相比，可在全轉錄組范圍對蛋白結合位點(diǎn)進(jìn)行篩選與鑒定；
      （2）高靈敏度：每個(gè)樣本可獲得數百萬(wàn)條的序列標簽，可發(fā)現研究轉錄組上稀有的蛋白結合位點(diǎn)；
      （3）高精確率：可獲得高水平的信噪比數據，準確區分真實(shí)事件與噪音，精確定位蛋白結合位點(diǎn)；
      （4）重復性好：深度測序保證了檢測隨機性，可不需技術(shù)重復。

生信分析流程

標準信息分析

      （1）將reads比對到基因組：將預處理reads與reference genome進(jìn)行mapping，最后得到mapping的sam結果文件，給出mapping結果統計；
      （2）peak detect：應用sam文件進(jìn)行peak富集區查找；
      （3）motif detect：查找結合位點(diǎn)區結構特性，尋找轉錄因子結合區域的motif結構；
      （4）基因關(guān)聯(lián)：應用結合位點(diǎn)區位置，確定其周?chē)婕暗幕颍?br />       （5）關(guān)聯(lián)基因GO差異分析：以參考基因組為背景集對結合位點(diǎn)關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行GO富集分析。

技術(shù)流程

樣本要求

      RIP捕獲的RNA>500ng，濃度>30ng/μL，OD260/280為1.8-2.0，OD260/230為1.5-1.8。

項目周期

      標準流程完成時(shí)間為50個(gè)工作日。

案例分析

案例（1）Rocaglates把DEAD-box蛋白eIF4A運輸到序列選擇性翻譯抑制物

       Rocaglamide A（RocA）代表一類(lèi)能夠選擇性殺傷非整倍體腫瘤細胞和抑制特殊mRNA翻譯的蛋白合成抑制劑。RocA作用于真核起始因子4A(eIF4A)，一種ATP依賴(lài)性的DEAD-box RNA解旋酶；它的mRNA選擇性是作用于高度結構化的5’非翻譯區，這一過(guò)程高度依賴(lài)于eIF4A-調節的解旋反應。然而，美國加州大學(xué)分子與細胞生物學(xué)系研究人員利用Rip-seq技術(shù)研究發(fā)現：Rocaglate（藥物）治療也許并不能從表現形式上復制eIF4A活性的缺失導致的缺陷，因為這藥物實(shí)際上只是增加了eIF4A和RNA的親和力。特別說(shuō)明的是5’非翻譯區的二級結構對于RocA選擇性而言只是一個(gè)次要的決定因素，同時(shí)該RocA不會(huì )通過(guò)降低eIF4A有效性來(lái)抑制翻譯。相反，在體外和細胞中，RocA以ATP非依賴(lài)性的方式特異性地將eIF4A夾送到polypurine序列中。本研究通過(guò)這個(gè)重要的抗癌化合物來(lái)闡明了選擇性翻譯抑制的重要機理。

圖1 由RocA選擇性翻譯抑制導致的作用于eIF4A的RNA序列選擇性改變

參考文獻
[1] Iwasaki et al. Rocaglates convert DEAD-box protein eIF4A into a sequence-selective translational repressor. Nature, 2016.