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miRNA是一類(lèi)高度保守的小RNA分子,它可以參與基因表達與調控、RNA的加工與剪切、蛋白質(zhì)翻譯、遺傳入侵抑制、配子發(fā)生等重要生物學(xué)過(guò)程,是生命活動(dòng)中必不可少的調控因子。miRNA測序技術(shù)采用膠分離技術(shù),收集樣本中18-30ntRNA片段,利用高通量測序技術(shù)對樣本中所有small RNA家族進(jìn)行測序和表達定量,從而解析miRNA 、siRNA 、piRNA 其它非編碼RNA等序列,并預測新的小RNA及其靶基因。
1、實(shí)驗方案
      測序策略:Illumina 平臺 SE50
      數據量:10M clean reads


2、技術(shù)優(yōu)勢
1)通量高:一次測序得到上千萬(wàn)條序列;
2)分辨率高:可以檢測小RNA單個(gè)堿基的差異;
3)精準度高:從幾個(gè)到幾十萬(wàn)個(gè)拷貝精確計數;
4)可重復性好:深度測序保證了抽樣隨機性,重復性好,無(wú)需重復實(shí)驗;
5)檢測范圍廣:既能鑒定已知小RNA,又能發(fā)現新的小RNA。


3、信息分析
3.1 標準信息分析
1)按標準流程進(jìn)行數據整理及數據質(zhì)量評估;
2)樣品間的公共序列和特異序列分析;
3)小RNA與參考基因組比對分析;
4)按照優(yōu)先級將小RNA進(jìn)行分類(lèi)注釋
5Novel Small RNA預測;
6)樣本間miRNA差異表達分析;
7)已知miRNA的家族分析;
8)已知miRNA差異分析(≥2個(gè)樣本)和聚類(lèi)分析(≥3個(gè)樣本);
9)已知miRNAnovel miRNA的靶基因預測;
10)已知miRNAnovel miRNA的靶基因GO注釋和KEGG通路分析;
11novel miRNA差異分析(≥2個(gè)樣本)和聚類(lèi)分析(≥3個(gè)樣本);
12)差異miRNA靶基因預測;
13)已知miRNA的堿基編輯分析;
3.2 高級信息分析
1snoRNA注釋
2piRNA注釋
3mir2disease注釋


4、技術(shù)流程


5、案例分析
       案例(1)小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中小RNA的動(dòng)態(tài)變化及其生物學(xué)功能
       該研究利用優(yōu)化的方法系統解析了小鼠卵子到受精后8細胞胚胎發(fā)育過(guò)程中的小RNA動(dòng)態(tài)變化,發(fā)現小鼠卵子和早期胚胎主要包含三類(lèi)小RNAendo-siRNA、piRNAmiRNA。受精卵中的這三類(lèi)小RNA絕大多數來(lái)源于卵子,由精子帶入卵子的小RNA不足幾百分之一。隨著(zhù)胚胎的發(fā)育,母源endo-siRNApiRNA逐漸被緩慢降解。而母源miRNA的降解較快,主要發(fā)生在胚胎2細胞期前后。合子中新表達的miRNA最早出現在受精卵第一次分裂前,并隨著(zhù)胚胎的發(fā)育持續被激活表達,特別是進(jìn)化保守的miRNA的表達量迅速上升。研究人員進(jìn)一步結合小鼠早期胚胎發(fā)育的轉錄組數據進(jìn)行分析,發(fā)現miRNA在卵子到胚胎2細胞期中幾乎沒(méi)有降解靶基因mRNA的功能,而在4-8細胞期中miRNA降解靶基因mRNA的功能開(kāi)始逐步恢復,并對合子激活表達的基因有明顯的靶向抑制作用。以上研究不僅揭示了小鼠早期胚胎發(fā)育中miRNA的表達和降解規律,還發(fā)現了miRNA對靶基因的調控活性隨著(zhù)胚胎發(fā)育而被動(dòng)態(tài)調控的現象,對于理解miRNA在早期胚胎發(fā)育中的功能和機制具有重要意義。

卵母細胞和早期胚胎中miRNA表達的動(dòng)態(tài)變化


       案例(2)人前列腺上皮和間質(zhì)細胞小RNA深度測序展示miRNA的差異類(lèi)型并首次預測靶點(diǎn)生長(cháng)因子
       本研究通過(guò)高通量測序方法對小RNA長(cháng)度進(jìn)行分類(lèi),繪制前列腺上皮(PrEC)和間質(zhì)細胞(PrSCmiRNA圖譜。PrEC測序共得到近76M reads,其中860468條為特異性序列。PrSC測序得到近76M reads,其中1百萬(wàn)條為特異性序列。鑒定得到許多高度保守及不保守的miRNA家族。與PrEC相比,16條在PrSC中顯著(zhù)高表達的miRNA得到進(jìn)一步分析。結果表明,這16miRNA的靶點(diǎn)基因主要涉及附著(zhù)連接、細胞附著(zhù)、EGRF、TGF-β和雄激素信號。腫瘤抑制Let-7家族miRNA在兩株細胞中高度表達。此外,鑒定得到PrECPrSC細胞中特異性表達的miRNA,預測它們的作用靶點(diǎn)為一組轉錄因子。

1 PrECPrSC的小RNA表達聚類(lèi)分析



2 功能基因重疊


參考文獻
[1] Yang et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances, 2016.
[2] Singh et al. Deep sequencing of small RNA libraries from human prostate epithelial and stromal cells reveal distinct pattern of microRNAs primarily predicted to target growth factors. Cancer Letters, 2016.

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