miRNA是一類(lèi)高度保守的小RNA分子，它可以參與基因表達與調控、RNA的加工與剪切、蛋白質(zhì)翻譯、遺傳“入侵”抑制、配子發(fā)生等重要生物學(xué)過(guò)程，是生命活動(dòng)中必不可少的調控因子。miRNA測序技術(shù)采用膠分離技術(shù)，收集樣本中18-30nt的RNA片段，利用高通量測序技術(shù)對樣本中所有small RNA家族進(jìn)行測序和表達定量，從而解析miRNA 、siRNA 、piRNA 其它非編碼RNA等序列，并預測新的小RNA及其靶基因。
1、實(shí)驗方案
測序策略：Illumina 平臺 SE50
數據量：10M clean reads
2、技術(shù)優(yōu)勢
（1）通量高：一次測序得到上千萬(wàn)條序列；
（2）分辨率高：可以檢測小RNA單個(gè)堿基的差異；
（3）精準度高：從幾個(gè)到幾十萬(wàn)個(gè)拷貝精確計數；
（4）可重復性好：深度測序保證了抽樣隨機性，重復性好，無(wú)需重復實(shí)驗；
（5）檢測范圍廣：既能鑒定已知小RNA，又能發(fā)現新的小RNA。
3、信息分析
3.1 標準信息分析
（1）按標準流程進(jìn)行數據整理及數據質(zhì)量評估；
（2）樣品間的公共序列和特異序列分析；
（3）小RNA與參考基因組比對分析；
（4）按照優(yōu)先級將小RNA進(jìn)行分類(lèi)注釋
（5）Novel Small RNA預測；
（6）樣本間miRNA差異表達分析；
（7）已知miRNA的家族分析；
（8）已知miRNA差異分析（≥2個(gè)樣本）和聚類(lèi)分析（≥3個(gè)樣本）；
（9）已知miRNA和novel miRNA的靶基因預測；
（10）已知miRNA和novel miRNA的靶基因GO注釋和KEGG通路分析；
（11）novel miRNA差異分析（≥2個(gè)樣本）和聚類(lèi)分析（≥3個(gè)樣本）；
（12）差異miRNA靶基因預測；
（13）已知miRNA的堿基編輯分析；
3.2 高級信息分析
（1）snoRNA注釋
（2）piRNA注釋
（3）mir2disease注釋
4、技術(shù)流程
5、案例分析
案例（1）小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中小RNA的動(dòng)態(tài)變化及其生物學(xué)功能
該研究利用優(yōu)化的方法系統解析了小鼠卵子到受精后8細胞胚胎發(fā)育過(guò)程中的小RNA動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現小鼠卵子和早期胚胎主要包含三類(lèi)小RNA：endo-siRNA、piRNA和miRNA。受精卵中的這三類(lèi)小RNA絕大多數來(lái)源于卵子，由精子帶入卵子的小RNA不足幾百分之一。隨著(zhù)胚胎的發(fā)育，母源endo-siRNA和piRNA逐漸被緩慢降解。而母源miRNA的降解較快，主要發(fā)生在胚胎2細胞期前后。合子中新表達的miRNA最早出現在受精卵第一次分裂前，并隨著(zhù)胚胎的發(fā)育持續被激活表達，特別是進(jìn)化保守的miRNA的表達量迅速上升。研究人員進(jìn)一步結合小鼠早期胚胎發(fā)育的轉錄組數據進(jìn)行分析，發(fā)現miRNA在卵子到胚胎2細胞期中幾乎沒(méi)有降解靶基因mRNA的功能，而在4-8細胞期中miRNA降解靶基因mRNA的功能開(kāi)始逐步恢復，并對合子激活表達的基因有明顯的靶向抑制作用。以上研究不僅揭示了小鼠早期胚胎發(fā)育中miRNA的表達和降解規律，還發(fā)現了miRNA對靶基因的調控活性隨著(zhù)胚胎發(fā)育而被動(dòng)態(tài)調控的現象，對于理解miRNA在早期胚胎發(fā)育中的功能和機制具有重要意義。
案例（2）人前列腺上皮和間質(zhì)細胞小RNA深度測序展示miRNA的差異類(lèi)型并首次預測靶點(diǎn)生長(cháng)因子
本研究通過(guò)高通量測序方法對小RNA長(cháng)度進(jìn)行分類(lèi)，繪制前列腺上皮（PrEC）和間質(zhì)細胞（PrSC）miRNA圖譜。PrEC測序共得到近76M reads，其中860468條為特異性序列。PrSC測序得到近76M reads，其中1百萬(wàn)條為特異性序列。鑒定得到許多高度保守及不保守的miRNA家族。與PrEC相比，16條在PrSC中顯著(zhù)高表達的miRNA得到進(jìn)一步分析。結果表明，這16條miRNA的靶點(diǎn)基因主要涉及附著(zhù)連接、細胞附著(zhù)、EGRF、TGF-β和雄激素信號。腫瘤抑制Let-7家族miRNA在兩株細胞中高度表達。此外，鑒定得到PrEC和PrSC細胞中特異性表達的miRNA，預測它們的作用靶點(diǎn)為一組轉錄因子。
參考文獻
[1] Yang et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances, 2016.
[2] Singh et al. Deep sequencing of small RNA libraries from human prostate epithelial and stromal cells reveal distinct pattern of microRNAs primarily predicted to target growth factors. Cancer Letters, 2016.
