細菌基因組測序/小基因組測序(10K~1M的DNA序列)

       細菌不但個(gè)體微小，其基因組也比動(dòng)植物小得多，一般在10M以?xún)?。微生物基因組測序能夠檢測微生物全基因組的核苷酸變異，通過(guò)全基因組測序，研究人員可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)、拷貝數變異(CNV)、插入缺失(InDel)、結構變異(SV)等變異信息，應用范圍涉及臨床醫藥研究、微生物致病性研究、物種進(jìn)化分析等領(lǐng)域。

       1、實(shí)驗方案

    測序策略：Illumina MiSeq PE250/PE300

     數據量：推薦測100×以上

2、數據分析

 2.1 標準信息分析

（1）按標準流程進(jìn)行數據整理及數據質(zhì)量評估

（2）K-mer分析以及基因組大小估計

（3）序列組裝

（4）組裝基因組的深度和覆蓋度分析

（5）組裝結果的核酸庫比對分析

（6）基因預測

（7）基因功能注釋(GO-COG/KOG)

（8）基因生物通路注釋(KEGG)

 2.2 高級信息分析

（1）基因組詳細信息環(huán)形圖

（2）共線(xiàn)性分析

（3）基因家族分析

（4）CRISPR預測

（5）基因島預測（毒力島）

（6）前噬菌體預測

（7）分泌蛋白預測

（8）動(dòng)植物病原菌致病性分析等

 3、技術(shù)流程

4、案例分析

案例（1）高通量測序分析發(fā)現新細菌

德國微生物學(xué)與細胞培養研究所微生物系最近從咸水環(huán)境微生物墊的低氧過(guò)渡區中分離培養獲得了一種中度嗜鹽，專(zhuān)性厭氧，分解糖類(lèi)的細菌，并編碼代號為L(cháng)12-Fru-AB^T。利用16s測序分析后發(fā)現該微生物應該代表著(zhù)一個(gè)新的種屬，研究發(fā)現該菌在各種缺/微氧環(huán)境中都廣泛存在，比如咸水環(huán)境，沸水和動(dòng)物腸道；隨后，研究人員利用全基因組測序方法對該菌進(jìn)行基因組序列分析，結合該菌的表型，推斷出L12-Fru-AB^T該菌及其相關(guān)細菌是能夠專(zhuān)門(mén)適應和利用微生物墊或生物膜產(chǎn)生的硫酸化的甘油聚合物。

圖1 基于16s rRNA基因測序的L21-Fru-AB^T在發(fā)育樹(shù)的位置圖

圖2 K.glycovorans L21-Fru-AB^T和幾個(gè)PVC superphylum的代表性細菌的基因組系統發(fā)育構成成分

案例（2）耐鹽耐堿性的克雷伯氏菌.D5A全基因組分析

中國科學(xué)院南京土壤研究所研究人員利用Hiseq2000測序平臺，采用Pair-end測序和mate pair測序的技術(shù)對克雷伯氏菌.D5A種屬進(jìn)行了全基因組測序，并對測序數據進(jìn)行了系統性分析。研究其有利于促進(jìn)植物生長(cháng)的相關(guān)基因，尤其是與耐鹽耐堿等相關(guān)基因。結果發(fā)現克雷伯氏菌.D5A種屬的基因組共為5,540,009bp，GC含量占57.15%，同時(shí)注釋了一些基因比如3-吲哚乙酸（IAA）合成基因，溶磷作用基因，含體細胞生成基因，羥基丁酮和2,3-丁二醇合成基因，還有固氮功能基因等。

圖1 Klebsiella sp. D5A種屬代謝通路和轉運系統一覽圖

       參考文獻