染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是在體內環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的經(jīng)典實(shí)驗方法,廣泛應用于組蛋白修飾、特定轉錄因子的基因調控作用等相關(guān)領(lǐng)域。隨著(zhù)新一代測序技術(shù)的發(fā)展和成熟,染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗與高通量測序的整合——ChIP-seq,可在全基因組范圍對蛋白結合位點(diǎn)進(jìn)行高效而準確的篩選與鑒定,同時(shí)也為研究的深入開(kāi)展打下基礎。
采用特異性抗體對目的蛋白進(jìn)行免疫沉淀后,分離與其結合的基因組DNA片段,再通過(guò)高通量測序與數據分析,在全基因組范圍內尋找目的蛋白的DNA結合位點(diǎn),并且可以基于多個(gè)樣品進(jìn)行差異比較。
1、實(shí)驗方案
測序策略:Illumina NextSeq 500 SE50
數據量:20M clean reads
2、數據分析
2.1 標準信息分析
(1)與參考序列比對
(2)Peak分析
(3)Peak在基因功能元件上的分布
(4)Peak相關(guān)基因分析
(5)Peak相關(guān)基因的GO功能顯著(zhù)性富集分析
(6)Peak相關(guān)基因的Pathway功能顯著(zhù)性富集分析
(7)鑒定樣品間差異Peak
(8)樣品間差異Peak的基因功能元件分布
(9)樣品間差異Peak相關(guān)基因分析
(10)樣品間差異Peak相關(guān)基因的GO功能顯著(zhù)性富集分析
(11)樣品間差異Peak相關(guān)基因的Pathway功能顯著(zhù)性富集分析
(12)motif結構域預測
3、技術(shù)流程
4、案例分析
案例(1)FOXO轉錄因子作用位點(diǎn)特征
FOXO轉錄因子(FOXO)是控制物種壽命的中心調控因子,但是FOXO執行特定的細胞功能,包括成人干細胞內穩和免疫功能。FOXO直接作用的靶點(diǎn)已經(jīng)在若干物種和細胞類(lèi)型中鑒定得到。用meta分析從組織到生物體,以及哺乳動(dòng)物,秀麗線(xiàn)蟲(chóng)和果蠅的FOXO靶向位點(diǎn)的數據。結果表明,FOXO作用的特定細胞是與細胞特定功能的相關(guān)的。而且FOXO在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中存在相同保守區域的作用位點(diǎn)。這些與生物生長(cháng),新陳代謝,抗壓力,蛋白質(zhì)平衡相關(guān)的保守區域的結合位點(diǎn)表明,這些生物可能擁有同一個(gè)祖先。
圖1 FOXO轉錄因子結合組織特異性的共同靶點(diǎn)
圖2 FOXO轉錄因子結合靶點(diǎn)韋恩圖和保守性分析
案例(2) 肝受體X和PPARG在癌細胞增殖不同調控機制的定義
肝受體X(LXRs,NR1H2,NR1H3)和PPAGR在HT29大腸癌細胞的信號進(jìn)行全面的,全基因組的以及各個(gè)發(fā)展階段的調控。PPAGR能夠產(chǎn)生快速的短期的回應,并且對相應的基因進(jìn)行活化。相對應的,肝受體X產(chǎn)生長(cháng)期持久的激活功能,抑制基因活化,提供了LXR和PPARG活化來(lái)調控癌癥細胞的生長(cháng)代謝的過(guò)程圖,為癌癥靶點(diǎn)治療指明了方向。
圖1 LXRs和PPARG的全基因組范圍的結合情況
參考文獻
[1] Webb et al. Characterization of the direct targets of FOXO transcription factors throughout evolution. Aging Cell, 2016.
[2] Savic et al. Distinct gene regulatory programs define the inhibitory effects of liver X receptors and PPARG on cancer cell proliferation. Genome Medicine, 2016.