近日，廣州華銀健康科技有限公司下屬子公司廣州華銀醫(yī)學研究所與南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學系團隊聯(lián)合撰寫的論文《非酒精性脂肪性肝炎診斷研究進展》在《藥學進展》線上發(fā)表。本次論文總結了廣州華銀健康科技有限公司在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）方面的探索和體會，證實了病理診斷在臨床診斷提供參考、改善患者診療效果方面的積極作用，為NASH診斷、新藥研發(fā)等方面的發(fā)展添磚加瓦。

專家介紹：

      醫(yī)學博士，廣州華銀醫(yī)學研究所首席技術官，華銀集團實驗室管理中心總監(jiān)、中國合格評定國家認可委員會（CNAS）醫(yī)學實驗室評審員，中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會組織生物樣本庫分會中醫(yī)藥學組委。曾多次參與 CNAS 組織的 ISO15189、17025、15195、CAP 實驗室認可工作，負責或參與過多個乙肝、丙肝、糖尿病、腫瘤等中心實驗室項目，參編人民衛(wèi)生出版社專著 6 部、獲得各級醫(yī)療科技成果獎勵 7 項、發(fā)表論文 32 篇、主持和參與國家科技支撐計劃等各級課題 16 項，開發(fā)過多個丙肝分型方法以及丙肝多個型別 NS3/4A、NS5A、NS5B 耐藥檢測方法，曾負責過乙肝、丙肝、糖尿病、實體腫瘤、血液腫瘤及其他疾病伴隨診斷項目的技術開發(fā)、管理工作。

廣州華銀醫(yī)學研究所有限公司：
      廣州華銀醫(yī)學研究所有限公司（下稱華銀醫(yī)學研究所），依托廣州華銀健康科技有限公司多元化與標準化的檢測平臺建立，專注于臨床研究及伴隨診斷業(yè)務，為客戶提供臨床前研究、Ⅰ～Ⅳ期藥物臨床研究、大型多中心研究的中心化檢測服務與解決方案，為藥物療效及安全性評價提供高質量數(shù)據；打造無縫的鏈接中心實驗室服務鏈條，覆蓋項目管理、采集包設計及供應、藥品及樣本冷鏈運輸、生物樣本管理等配套服務。在盡可能短的時間內獲得高質量的研究結果，為客戶創(chuàng)造價值。

正文：

龍健靈 1，徐蕙 1，曾夢 1，楊磊 2，鄭松柏 1*

（1. 廣州華銀醫(yī)學研究所有限公司，廣東 廣州 510700；2. 南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學系，廣東 廣州 510515）

▌摘要
      非酒精性脂肪性肝病是一種慢性非傳染性疾病。近年來其患病率和發(fā)病率不斷增高，發(fā)病年齡也出現(xiàn)低年齡化趨勢，該疾病已取代慢性乙型肝炎成為第一大慢性肝臟疾病。重點綜述非酒精性脂肪性肝病中的非酒精性脂肪性肝炎的診斷研究進展，介紹非酒精性脂肪性肝炎的臨床病史、病理學診斷、非侵入方法診斷，為臨床診斷提供參考。

      非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種慢性、非傳染性流行病。全球NAFLD的流行率約為25%。在亞洲，從城市到農村地區(qū)的患病率從高到低呈梯度變化。近年來NAFLD患病率、發(fā)病率不斷增高，發(fā)病年齡也出現(xiàn)低年齡化趨勢，目前NAFLD已經取代了慢性乙型肝炎，成為第一大慢性肝臟疾病。此外，NAFLD在兒童中的流行率也很高，約為10%。

      NAFLD兩種常見的臨床表現(xiàn)為非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL，又稱單純性脂肪肝）和非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）。NAFL往往是良性非進展性疾病，而NASH可進展為肝硬化，在極少數(shù)情況下可導致肝細胞癌（HCC）。

      NASH的診斷應排除：①過量飲酒史（男性>210g·d-1，女性>140g·d-1）；②藥物導致的肝臟損傷；③其他肝臟疾病。目前，肝臟活檢依然是公認的NASH診斷金標準。近年來隨著醫(yī)學技術的發(fā)展，影像學及生物標志物越來越多地被應用于NASH的診斷，本文從臨床病史、病理學診斷、非侵入方法診斷等方面，對NASH的綜合診斷研究進展進行綜述。

▌臨床病史
      對肥胖、糖尿病或多發(fā)性硬化癥患者，應進行NAFLD 的篩查。大部分 NAFL 或輕度 NASH 患者無明顯癥狀，有時會出現(xiàn)輕微的上腹壓迫感及易疲勞。大多數(shù)情況下，患者在常規(guī)體檢中，常常由于血生化檢測顯示肝酶升高或超聲檢測顯示肝臟脂肪變性，而疑似 NAFLD。因此對于肥胖、高尿酸、2 型糖尿病患者以及三高（高血壓、高血脂、高膽固醇）人群應重視 NAFLD 的篩查。此外，由藥物、毒素、脂肪代謝障礙、自身免疫和嚴重炎癥疾病等因素引起的肝臟脂肪變性，在 NAFLD 的確診中， 應進行充分評估。

▌病理診斷
      肝臟活檢仍然是診斷 NASH 的金標準，也是目前唯一能可靠區(qū)分 NAFL 和 NASH 的方法；此外還是評估 NASH 患者肝臟疾病進展或消退的有價值的檢測方法。NASH 與酒精性肝病相似，隨病程的進展而表現(xiàn)不同，包括肝細胞的脂肪變性、壞死、炎性細胞浸潤和 Mallory-Denk 小體形成，甚至有纖維化和假小葉形成。目前普遍將脂肪變性作為NASH 最基本的病理學表現(xiàn)。 

      為了更好地評估 NASH 的疾病發(fā)展過程，為臨床提供可量化的病理組織學評估，以及對治療效果進行科學評價，近年來，病理學者致力于建立一套科學的組織學評估系統(tǒng)。NASH 臨床研究網絡病理委員會（the Pathology Committee of NASH ClinicalResearch Network，NASH-CRN）提出，NASH是指在沒有大量飲酒的情況下，通過肝臟活檢發(fā)現(xiàn)存在脂肪變性、炎癥和肝細胞氣球樣變化，并且制定 NAFLD 活動評分（NAS）的分級系統(tǒng)，該系統(tǒng)由 14 項組織學指標構成，其中 4 項進行半定量計分，包括：脂肪變性（0 ~ 3）、小葉內炎癥（0 ~3）、肝細胞氣球樣變（0 ~ 2）、纖維化（0 ~ 4），另外 9 項以“有”或“無”表示（見表 1）。NAS對各項組織學指標并無偏重，區(qū)分組織學改變的目的是為了評估整個 NAFLD 活動度，而不是評估NASH 嚴重程度和進行 NASH 診斷，但 NAS 不能作為 NASH 進展程度的評判尺度，它主要用于臨床NASH 治療后組織學改變的評估。學術界對 NASH的組織學特征及 NAS 仍存在較大的爭議，不同的病理學家對 NASH 的定義也不盡相同，對于病理工作者而言，準確地診斷 NASH 仍存在一定的難度。在此基礎上，美國肝臟疾病研究協(xié)會（Association forthe Study of Liver Diseases，AASLD）提出了一個對于臨床應用更加實用的標準，即脂肪變性 > 5%、不同程度的肝細胞氣球樣變、不同程度的小葉炎癥，該標準更加精確地提出了 3 種指標的最低標準，得到更多肝病學家及病理學家的認可，也為多中心流行病學研究和臨床試驗提供了理論基礎。

      由于纖維化被認為是 NASH 進展階段的一個標志，學術界近期提出一種改進的評分系統(tǒng)，稱為SAF 評分，即：脂肪變性（steatosis，S，0 ~ 3）；活動等級（activity，A，0 ~ 4）是氣球樣變（0 ~ 2）和小葉炎癥（0~2）的未加權相加；纖維化（fibrosis，F(xiàn)，0~4）[11]。相比于 NASH-CRN 提出的評分系統(tǒng)，SAF 評分在脂肪變性和氣球樣變上增加了對肝細胞大小及形狀的描述。以含有大中型胞質內脂滴的肝細胞百分比評估脂肪變性（S0：< 5%；S1：5% ~33%；S2：34% ~ 66%；S3：> 67%）。肝細胞氣球樣變程度分為 0 級（0 級：正常肝細胞，呈長方體形狀，棱角分明，胞質呈粉紅色，嗜酸性）、1 級（存在肝細胞簇，呈圓形，胞質蒼白，常呈網狀，形狀雖不同，但大小與正常肝細胞相似）和 2 級（與1 級氣球樣變肝細胞簇內的正常細胞相比，至少為 2倍大小）。小葉炎癥定義為小葉內有 2 個或 2 個以上的炎性細胞的病灶，在低倍鏡下計數(shù)，分為0級（無病灶）、1 級（每個小葉 < 2 個病灶）和 2 級（每小葉 > 2 個病灶）?；?SAF 評分，研究者提出了一種算法——脂肪肝進展抑制（fatty liver inhibitionof progression，F(xiàn)LIP）算法，用于區(qū)分在存在脂肪病變（即 S ≥ 1）的情況下的 NASH 和非 NASH。FLIP 算法根據 SAF 的 3 個基本特征（脂肪變性、氣球樣變、小葉炎癥）評價得分對 NASH 進行分類區(qū)分，對于至少有 5% 的脂肪病變（即 S ≥ 1）的病例，該算法列舉了 9 種可能情況進行診斷區(qū)別（見圖 1）。此外，根據活動等級（A）和纖維化程度（F）來定義整體組織學嚴重程度，分成與 NASH 輕度疾?。ˋ<2 和 F<2）和嚴重疾?。ˋ>2 和/或 F>2）。研究表明，基于 SAF 評分的 FLIP 算法可以減少病理學家、觀察者之間的評定差異，更適用于臨床診斷應用。 

      然而，任何的評分系統(tǒng)都不能完全代替肝臟活檢的分析描述，進行肝臟活檢時，獲取高質量的組織標本是非常重要的?；顧z標本的長度為 10 ~ 30mm，直徑為1.2~2 mm，占肝臟總質量的1/50 000，因此存在取樣誤差的重大風險。標本長度不夠或碎片化、取樣錯誤和觀察者之間的差異等因素，將影響對肝臟損傷程度的正確評估。病理學家的經驗程度也可能影響觀察者之間的一致性。即使是專業(yè)的肝臟病理學家，NAS 評分也可能會有 1~2 個點的差異，而且纖維化評分可能會有 1 個點的差異。Gunn 等認為，不是所有疑似患有 NAFLD的患者，都要進行肝活檢。只有當肝活檢可以改變患者的治療建議，使患者意識到自己有嚴重的肝臟疾病，或者在臨床數(shù)據不一致的患者中確認或排除NAFLD 時，才應進行肝臟活檢。疑似患者的肝轉氨酶、肝超聲、其他原因引起肝病的血清學檢測數(shù)據，以及患者是否有代謝綜合征或超重等因素，應作為判斷是否進行肝臟活檢的依據。另外，大約 30% 的肝臟活檢病例伴有短暫的疼痛、焦慮和不適，甚至可能危及生命的并發(fā)癥（0.3% 的病例出血，0.01%的病死率）。

▌非侵入方法診斷
      隨著醫(yī)學技術的不斷發(fā)展，一些無創(chuàng)的方式越來越多被應用于診斷與預測 NASH 及階段性肝纖維化。這些方法包括預測模型 [ 增強型肝纖維化（ELF）評分 ] 和血清生物標志物檢測。瞬時彈性成像（FibroScan，TE）或磁共振彈性成像（MRE）技術被用于評估肝硬度，可作為潛在肝纖維化的評估技術?？傊?，開發(fā)準確、安全和易于使用的非侵入性方法，以準確診斷和監(jiān)測 NASH 和相關的纖維化，在臨床實踐和臨床研究中具有極其重要的意義。這些檢測不僅對于進展性肝病的最大風險分層很重要，而且可以作為 NASH 治療性臨床試驗的適當替代終點。

▌常規(guī)實驗室診斷
      NAFLD 的實驗室診斷中，最常見的異常參數(shù) 為血清谷草轉氨酶（AST）和谷丙轉氨酶（ALT）， 在排除其他原因的肝臟損傷后，可作為 NAFLD 的 支持診斷 [16]。當 AST 與 ALT 比值<1 可作為 NASH 的支持診斷。但部分 NAFL 患者甚至 NASH 患者的 血清轉氨酶處于正常水平，因此該參數(shù)不夠敏感。與其他肝臟疾病相同，NAFLD 患者血清谷氨酰轉 肽酶（GGT）和膽堿酯酶、血清鐵蛋白水平也升高。在區(qū)分 NAFLD 與其他肝臟疾病中，常規(guī)實驗室的性能參數(shù)的敏感性及特異性沒有達到令人滿意的水平。然而，臨床和實驗室參數(shù)被納入預測模型時可 以提高診斷準確性。 

      各種評分系統(tǒng)也被逐步用于評估與預測 NASH，這些系統(tǒng)都是基于各種臨床表現(xiàn)和現(xiàn)成的生化檢測，包括 BARD 評分（包括 BMI、AST 與 ALT 比值、是否有糖尿病）、NAFLD 纖維化評分（包括年齡、BMI、是否有胰島素抵抗或糖尿病、 AST、ALT和血清白蛋白），以及FIB-4（包括年齡、 AST、ALT 和血小板計數(shù)）。

▌影像學診斷 
      超聲檢查是脂肪肝變性診斷的一線檢測工具，然而超聲波檢測微小脂肪變性能力很差，因此超聲檢測無法區(qū)分單純性脂肪變性、NASH以及肝硬化。計算機斷層掃描（CT）只能評估中度脂肪變性，不能檢測早期肝硬化或肝纖維化的程度。此外，還有輻射暴露的缺點。因此，CT 不作為診斷 NAFLD 的常規(guī)項目。 

      磁共振成像（MRI）在檢測微小脂肪變性和脂肪量化方面，優(yōu)于超聲檢測和 CT 檢測。Leporq 等通過同時定量 NAFLD 患者的肝臟脂肪含量、脂肪酸組成、T2* 橫向松弛時間和磁化率，建立了脂肪性肝炎的診斷的磁共振定量檢測方案。該研究對 32例經活檢證實的非脂肪肝性疾病患者進行驗證，其中 12 例患有單純性脂肪變性，20 例患有 NASH。32 例患者中，單純性脂肪變性和 NASH 患者的肝臟脂肪組分和 T2* 橫向松弛時間和磁化率無明顯變化。相比之下，NASH 患者的飽和脂肪酸含量比單純性脂肪變性患者高（48.2% vs 44.4%，P < 0.05），磁化率下降（P<0.001），特征曲線下面積為 0.91（95%CI 為 0.79 ~ 1.0）。該研究表明，對肝臟脂肪含量、脂肪酸組成、T2* 橫向松弛時間和磁化率同時進行磁共振定量的檢測方案對 NASH 的診斷具有較高的診斷價值。

      TE 是近年來應用較廣的一種非侵入性檢測方法，用于評估肝臟纖維化程度以及肝臟硬度。Boursier 等 [22] 報道了 TE 評估的肝纖維化的陰性預測值（NPV）為 90%，敏感性為 88%，陽性預測值（PPV）為65%，與血液檢測相比，更少的患者（43.6%）處于“灰色區(qū)域”。

▌基于生物標志物的診斷
      NASH 的診斷依賴于肝活檢，同時也受到病理學家的觀察者間差異的限制。越來越多的研究者關注無創(chuàng)診斷，是否能找到適合的生物標志物成為NASH 診斷的一個關鍵。 

      NASH 中肝臟損傷的發(fā)病機制復雜，涉及多種激素、細胞和分子的干擾。這一復雜性導致了許多潛在的 NASH 生物標志物的產生，這些標志物反映了潛在的疾病途徑，包括肝細胞凋亡、炎癥、氧化應激和異常的脂肪信號。血清轉氨酶水平目前仍然是評估慢性肝病最常用的血液參數(shù)，然而，研究表明單獨的 ALT 水平不能很好地預測 NASH。 

      與單純的脂肪變性相比，NASH 使肝細胞凋亡或壞死增加，并導致細胞角蛋白 18（CK18）水平上調。然而，基于 CK18 的診斷方法敏感性和特異性分別為 66% 和 82%，在臨床應用中仍不夠準確，為增加診斷價值，研究人員將 CK18 與血清凋亡介導表面抗原 FAS（sFAS）水平聯(lián)合使用作為檢測指標，其中 sFAS 參與激活肝細胞內的外源性凋亡通路。一項研究表明，CK18 的 M30 片段（CK18-M30）和 sFAS 水平的結合使用具有合理到極好的準確性（曲線下面積為 0.79~0.93），但其臨床應用還亟待進一步的驗證研究。 

      炎癥是 NASH 的組織學特征之一，因此血清中C-反應蛋白（CRP）、IL-1受體拮抗劑蛋白（IL-1RA）、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子（TNF）以及 CXC- 趨化因子 10（CXCL10）等多種炎癥標志物和介質水平被作為診斷標志物的研究對象。在一項 648 例經活檢證實的 NAFLD 患者參加的研究中，對 32 個血漿生物標志物進行檢測后，發(fā)現(xiàn) IL-8、可溶性 IL1R1、總纖溶酶原激活物抑制劑 1（PAI1）和激活的 PAI1（aPAI1）的水平與 NASH 相關。然而，在排除臨床和代謝因素后，只有 aPAI1 仍然可以預測NASH。aPAI1 作為纖維蛋白溶解抑制劑，通過調控凝血功能從而增加心血管風險，但該指標不太可能是作為一項唯一標志物，還需通過進一步的研究與其他標志物聯(lián)合診斷。 

      氧化應激是 NASH 中肝臟損傷的主要致病機制之一，可對其導致的脂質氧化和血清產物進行檢測。Feldstein 等利用質譜法研究發(fā)現(xiàn)脂質氧化產物[11-羥基二十碳四烯酸（11-HETE）、羥基十八碳二烯酸（HODE）、氧化十八碳二烯酸（oxo-ODE）]與 NASH 相關，由 13-HODE 比值 + 年齡、BMI 和AST 構成 oxNASH 評分，該評分目前已被證實對NASH 具有合理的診斷準確性。然而，對特殊設備的需求和標本處理的成本目前限制了脂質氧化產物作為 NASH 診斷工具的廣泛應用。 

      脂肪因子 [ 包括脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素、內脂素（NAMPT）、視黃醇結合蛋白 4（RBP4）、脂肪酸結合蛋白 4（FABP4））] 和肝源性激素 [ 如成纖維細胞生長因子 21（FGF21）] 參與 NAFLD 的發(fā)病過程，并與 NAFLD 的嚴重程度密切相關，但不是 NASH 的特異性血清標志物。2017 年發(fā)表的一項研究分析表明血清 FGF21 水平與 NASH 之間存在一定的關聯(lián)，然而，該生物標志物的敏感性和特異性僅分別為 62% 和 78%。鐵蛋白作為一種急性期反應物，在 NAFLD 和代謝綜合征患者中常呈現(xiàn)為水平上調。有研究表明高鐵蛋白血癥與 NAFLD患者的晚期纖維化之間存在相關性。

      肝纖維化是數(shù)百萬肝病患者的常見病，但由于其分子機制的不明確，目前尚無有效的治療方法。南方醫(yī)科大學病理系周偉杰教授團隊最新研究揭示了白細胞衍生趨化因子-免疫球蛋白樣表皮生長因子同源性家族受體酪氨酸激酶 1（LECT2-Tie1）信號通路通過調控肝臟門脈血管新生和肝血竇毛細血管化進而調控肝纖維化進程的新機制，并提出了應區(qū)別對待門脈血管新生和肝血竇毛細血管化在肝纖維化進展中的不同作用的新觀點，提出靶向 LECT2/Tie1 信號通路可能是肝纖維化的潛在治療靶點，血清 LECT2 水平可能是篩選和診斷肝纖維化的潛在生物標志物。 

      CK18 是 NASH 診斷中應用最廣泛的血清學檢測指標，但 CK18 的診斷準確性僅為中等水平，盡管其他生物標志物或組合診斷有望成為診斷指標，但大多數(shù)尚未得到驗證。不同的 NASH 生物標志物在臨床試驗中的應用取決于研究藥物的作用機制。例如，用于評估代謝變化、凋亡或細胞死亡、炎癥或纖維形成的生物標志物可能與靶向肝細胞凋亡的藥物更為相關。

▌結語與展望
      在過去的幾十年里，我們對 NAFLD 的認知，已經從一個無法識別的實體演變成一個具有共同表現(xiàn)型肝脂肪變性的異質性重疊肝臟疾病的集合體。NAFLD 相當普遍，影響了全世界大約 25% 的成年人群體，其中的 NASH 患者，特別是伴有嚴重纖維化的患者，在不良臨床結果、死亡率以及重大經濟負擔方面面臨著較高風險。慶幸的是，全球醫(yī)學研究機構和產業(yè)界慢慢認識到該疾病的危害性，已在該領域投入大量人力和資金，相信在若干年以后，將有更加簡單而精準的診斷手段及良好治療藥物面世，為患者帶來福音。