16S rDNA是指細(xì)菌基因組中編碼核糖體16S rRNA分子所對(duì)應(yīng)的DNA序列，序列全長(zhǎng)約1540bp，包含10個(gè)保守區(qū)和9個(gè)高變區(qū)（V1-V9）。保守區(qū)序列在細(xì)菌間差異不大而高變區(qū)則具有種屬特異性，因此最常用作細(xì)菌分類標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)對(duì)環(huán)境樣品的細(xì)菌總DNA進(jìn)行提取，擴(kuò)增其中16S rDNA基因，可以鑒定出絕大多數(shù)細(xì)菌類別。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的新興的組學(xué)技術(shù)，是系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分。其對(duì)生物體內(nèi)所有小分子代謝物進(jìn)行定性定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對(duì)關(guān)系的研究方式，其研究對(duì)象大都是分子量1500以內(nèi)的小分子物質(zhì)。

16S只是研究了腸道微生物的構(gòu)成和組份的改變與宿主的生理以及人類的疾病相關(guān)。然而，腸道微生物對(duì)宿主的作用其中一方面貢獻(xiàn)是通過(guò)腸道中微生物產(chǎn)生的小分子次級(jí)代謝產(chǎn)物，通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)來(lái)作用于人體的各個(gè)部位，調(diào)控宿主體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，比如許多研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物的代謝產(chǎn)物對(duì)糖尿病、高血壓、心臟病和抑郁、腸道的免疫等疾病都有影響。16S可以得到樣本當(dāng)中有哪些微生物，和預(yù)測(cè)他們的功能，而代謝組學(xué)研究代謝物的表達(dá)量、代謝物與生理病理變化的關(guān)系，能夠幫助確定這些功能是否真的發(fā)生了，發(fā)生的程度是什么樣的。兩者的聯(lián)用，可以通過(guò)代謝組結(jié)果的檢測(cè)輔助和驗(yàn)證16S分析結(jié)果；兩者的聯(lián)合分析可以得到微生物多樣性、種類、相對(duì)豐度與代謝物豐度的關(guān)聯(lián)。

①基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的微小變化會(huì)在代謝物水平得到放大；

②代謝組學(xué)的研究不需進(jìn)行全基因組測(cè)序及建立大量表達(dá)序列標(biāo)簽的數(shù)據(jù)庫(kù)；

③代謝物種類遠(yuǎn)少于基因和蛋白的數(shù)目，每個(gè)生物體中代謝產(chǎn)物大約在10³數(shù)量級(jí)，而最小的細(xì)菌，其基因組中也有幾千個(gè)基因；

④生物體液的代謝物分析可反映機(jī)體系統(tǒng)的生理和病理狀態(tài)。

如果沒有特別關(guān)注的代謝物質(zhì)建議選擇非靶標(biāo)，可以檢測(cè)出某一特定條件下所有的代謝產(chǎn)物，并進(jìn)行定性和相對(duì)定量分析，以尋找目標(biāo)差異代謝物；如果有關(guān)注的目標(biāo)代謝物建議選擇高通量靶標(biāo)代謝組，對(duì)特定的代謝物群進(jìn)行有針對(duì)性的特異性檢測(cè)。

代謝組與16S聯(lián)用時(shí)，16S的樣品主要是糞便和腸道內(nèi)容物；而代謝組的樣本主要是糞便、血漿或血清、尿液等（具體項(xiàng)目可以參考相應(yīng)的參考文獻(xiàn)）。

臨床標(biāo)本：每組100例（不少于30例，越多越好）

模式動(dòng)物：每組12個(gè)樣品（不少于8個(gè)，越多越好）

注意：遵從“保持最鮮活的狀態(tài)”原則，通過(guò)低溫、淬滅的方法阻止離體后的代謝活動(dòng)。樣品不能pooling，不能反復(fù)凍融；血清/血漿不能溶血；如果是用血漿，請(qǐng)用肝素鈉抗凝，EDTA抗凝效果不好。

相較于基因和蛋白，代謝物處于生命活動(dòng)的下游，動(dòng)態(tài)波動(dòng)性大。因此需要很多生物學(xué)重復(fù)來(lái)增加數(shù)據(jù)的可靠性和說(shuō)服力。

建議取樣時(shí)間一致。

若代謝組和16S樣本類型一樣，那么在收集樣品的時(shí)候可以多準(zhǔn)備一份樣品，即一個(gè)樣分裝至少2兩管，一管用于16S，一管用于代謝組。

若代謝組和16S樣本類型不一樣，也應(yīng)該要保持一樣的取樣時(shí)間。

最好不要分成兩批檢測(cè)，因?yàn)檫@兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)儀器的響應(yīng)會(huì)發(fā)生變化，這樣可能導(dǎo)致的問(wèn)題是一些含量低的物質(zhì)可能只在一個(gè)批次里被檢出。

代謝組學(xué)的技術(shù)平臺(tái)主要分為NMR（核磁共振譜）、GC-MS（氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）、LC-MS（液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）。

NMR的特點(diǎn)是樣品需求量小，前處理比較簡(jiǎn)單，對(duì)于復(fù)雜的生物樣本比較合適；但對(duì)讀譜人員的要求高；靈敏度低，檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍有限。

GC-MS和LC-MS的特點(diǎn)是結(jié)合了色譜良好的分離能力和質(zhì)譜的普適性、高靈敏度以及專一性，具體而言GC-MS分辨率、選擇性好，數(shù)據(jù)庫(kù)較為健全，但樣品處理過(guò)程繁瑣；LC-MS靈敏度、分辨率高，可以分析不穩(wěn)定、不易衍生化、難揮發(fā)和分子量大的代謝物，可對(duì)極性化合物有較好的檢測(cè)。但數(shù)據(jù)庫(kù)不健全，可鑒定的化合物有限。

因此在選擇平臺(tái)時(shí)應(yīng)結(jié)合自身樣本情況與個(gè)體需求，綜合考慮。

使用靈敏度更高、分辨率更高、定性能力更強(qiáng)的質(zhì)譜儀代替了光學(xué)檢測(cè)器。將色譜的分離能力和質(zhì)譜的分辨、定性能力強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，可以對(duì)更多的物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。

通過(guò)腸道菌群非靶向代謝組學(xué)的自建數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出代謝物是微生物特有的，哪些是共有的，哪些是宿主的。

注：1166個(gè)腸道菌群特有的代謝物（其中884個(gè)有MS2譜圖），868個(gè)人菌共有的代謝物，366個(gè)人特有的代謝物，合計(jì)共2400個(gè)。

如果沒有找到差異代謝物，那么還可以就檢測(cè)到的物質(zhì)進(jìn)行KEGG Patheway分析，即對(duì)代謝物參與的代謝通路進(jìn)行研究，觀察是否有其他的補(bǔ)給途徑、代謝途徑與疾病之間是否存在一定的關(guān)聯(lián)性。

建議根據(jù)物質(zhì)的KEGG名稱和CAS號(hào)在“愛化學(xué)”（http://www.ichemistry.cn/）網(wǎng)站查詢中文名稱。

一般是使用 P值<0.05 & VIP>1這樣的卡值來(lái)進(jìn)行差異物的篩選。

P值來(lái)源單元變量統(tǒng)計(jì)分析，VIP值來(lái)源于多元變量統(tǒng)計(jì)分析（來(lái)源于 OPLS-DA模型）表征該變量對(duì)兩組差異的貢獻(xiàn)值，當(dāng)然VIP值越大對(duì)差異貢獻(xiàn)越大。

使用P值<0.05 & (FC>2或FC<0.5) [FC= Fold change]來(lái)進(jìn)行差異物篩選也是有這樣的做法，但是P值和FC值都來(lái)源單元變量統(tǒng)計(jì)分析。推薦使用P值<0.05 & VIP>1的篩選方法。

在此基礎(chǔ)上要做進(jìn)一步的篩選的話，有以下幾個(gè)方法：

1）P 值<0.05，對(duì)VIP值做排序（VIP值越大，差異代謝物越有意義）

2）VIP>1，對(duì) P值做排序（P值越小，差異代謝物越有意義）

3）在 P 值<0.05 & VIP>1 的范圍內(nèi)，對(duì)FC值做排序（大于2的FC，越大越有意義；小于0.5的FC，越小越有意義）

限定更嚴(yán)格的基礎(chǔ)篩選條件，比如：P值<0.01 & VIP>2。重做以上三種方法。