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集團(tuán)新聞

16S+代謝組學(xué)聯(lián)用常見問(wèn)題一攬子告訴你答案

2023-01-12 閱讀數(shù):5130





微生物16S分析鑒定了樣本中微生物的種類和可能具有的功能,但是微生物真的有這樣的功能嗎?怎么能快速準(zhǔn)確地做出鑒定呢?那就來(lái)試試16S+代謝組學(xué)聯(lián)用的方法吧。


組學(xué)聯(lián)用,一個(gè)鑒定微生物種類,一個(gè)鑒定微生物功能,還能發(fā)高分文章,why not?


1、16S是什么?

16S rDNA是指細(xì)菌基因組中編碼核糖體16S rRNA分子所對(duì)應(yīng)的DNA序列,序列全長(zhǎng)約1540bp,包含10個(gè)保守區(qū)和9個(gè)高變區(qū)(V1-V9)。保守區(qū)序列在細(xì)菌間差異不大而高變區(qū)則具有種屬特異性,因此最常用作細(xì)菌分類標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)對(duì)環(huán)境樣品的細(xì)菌總DNA進(jìn)行提取,擴(kuò)增其中16S rDNA基因,可以鑒定出絕大多數(shù)細(xì)菌類別。


2、代謝組學(xué)是什么?

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的新興的組學(xué)技術(shù),是系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分。其對(duì)生物體內(nèi)所有小分子代謝物進(jìn)行定性定量分析,并尋找代謝物與生理病理變化的相對(duì)關(guān)系的研究方式,其研究對(duì)象大都是分子量1500以內(nèi)的小分子物質(zhì)。


3、為什么要選擇做16S+代謝組學(xué)?

16S只是研究了腸道微生物的構(gòu)成和組份的改變與宿主的生理以及人類的疾病相關(guān)。然而,腸道微生物對(duì)宿主的作用其中一方面貢獻(xiàn)是通過(guò)腸道中微生物產(chǎn)生的小分子次級(jí)代謝產(chǎn)物,通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)來(lái)作用于人體的各個(gè)部位,調(diào)控宿主體內(nèi)的穩(wěn)態(tài),比如許多研究發(fā)現(xiàn),腸道微生物的代謝產(chǎn)物對(duì)糖尿病、高血壓、心臟病和抑郁、腸道的免疫等疾病都有影響。16S可以得到樣本當(dāng)中有哪些微生物,和預(yù)測(cè)他們的功能,而代謝組學(xué)研究代謝物的表達(dá)量、代謝物與生理病理變化的關(guān)系,能夠幫助確定這些功能是否真的發(fā)生了,發(fā)生的程度是什么樣的。兩者的聯(lián)用,可以通過(guò)代謝組結(jié)果的檢測(cè)輔助和驗(yàn)證16S分析結(jié)果;兩者的聯(lián)合分析可以得到微生物多樣性、種類、相對(duì)豐度與代謝物豐度的關(guān)聯(lián)。


4、代謝組學(xué)與其他組學(xué)相比,有什么優(yōu)勢(shì)?

①基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的微小變化會(huì)在代謝物水平得到放大;

②代謝組學(xué)的研究不需進(jìn)行全基因組測(cè)序及建立大量表達(dá)序列標(biāo)簽的數(shù)據(jù)庫(kù);

③代謝物種類遠(yuǎn)少于基因和蛋白的數(shù)目,每個(gè)生物體中代謝產(chǎn)物大約在103數(shù)量級(jí),而最小的細(xì)菌,其基因組中也有幾千個(gè)基因;

④生物體液的代謝物分析可反映機(jī)體系統(tǒng)的生理和病理狀態(tài)。


5、與16S聯(lián)用時(shí),如何選擇是用非靶標(biāo)代謝組還是高通量靶標(biāo)代謝組?

如果沒有特別關(guān)注的代謝物質(zhì)建議選擇非靶標(biāo),可以檢測(cè)出某一特定條件下所有的代謝產(chǎn)物,并進(jìn)行定性和相對(duì)定量分析,以尋找目標(biāo)差異代謝物;如果有關(guān)注的目標(biāo)代謝物建議選擇高通量靶標(biāo)代謝組,對(duì)特定的代謝物群進(jìn)行有針對(duì)性的特異性檢測(cè)。


6、16S 與代謝組聯(lián)用時(shí),一般檢測(cè)哪些樣品類型?樣本量需要多少?

代謝組與16S聯(lián)用時(shí),16S的樣品主要是糞便和腸道內(nèi)容物;而代謝組的樣本主要是糞便、血漿或血清、尿液等(具體項(xiàng)目可以參考相應(yīng)的參考文獻(xiàn))。

臨床標(biāo)本:每組100例(不少于30例,越多越好)

模式動(dòng)物:每組12個(gè)樣品(不少于8個(gè),越多越好)

注意:遵從“保持最鮮活的狀態(tài)”原則,通過(guò)低溫、淬滅的方法阻止離體后的代謝活動(dòng)。樣品不能pooling,不能反復(fù)凍融;血清/血漿不能溶血;如果是用血漿,請(qǐng)用肝素鈉抗凝,EDTA抗凝效果不好。


7、代謝組為什么需要這么多生物學(xué)重復(fù)?

相較于基因和蛋白,代謝物處于生命活動(dòng)的下游,動(dòng)態(tài)波動(dòng)性大。因此需要很多生物學(xué)重復(fù)來(lái)增加數(shù)據(jù)的可靠性和說(shuō)服力。


8、代謝組和16S的樣品取樣時(shí)間可以不一致?

建議取樣時(shí)間一致。

若代謝組和16S樣本類型一樣,那么在收集樣品的時(shí)候可以多準(zhǔn)備一份樣品,即一個(gè)樣分裝至少2兩管,一管用于16S,一管用于代謝組。

若代謝組和16S樣本類型不一樣,也應(yīng)該要保持一樣的取樣時(shí)間。


9、同一樣本的代謝組為什么不能分兩批檢測(cè)?

最好不要分成兩批檢測(cè),因?yàn)檫@兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)儀器的響應(yīng)會(huì)發(fā)生變化,這樣可能導(dǎo)致的問(wèn)題是一些含量低的物質(zhì)可能只在一個(gè)批次里被檢出。


10、代謝組學(xué)我該選擇哪個(gè)平臺(tái)?

代謝組學(xué)的技術(shù)平臺(tái)主要分為NMR(核磁共振譜)、GC-MS(氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)、LC-MS(液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)。

NMR的特點(diǎn)是樣品需求量小,前處理比較簡(jiǎn)單,對(duì)于復(fù)雜的生物樣本比較合適;但對(duì)讀譜人員的要求高;靈敏度低,檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍有限。

GC-MS和LC-MS的特點(diǎn)是結(jié)合了色譜良好的分離能力和質(zhì)譜的普適性、高靈敏度以及專一性,具體而言GC-MS分辨率、選擇性好,數(shù)據(jù)庫(kù)較為健全,但樣品處理過(guò)程繁瑣;LC-MS靈敏度、分辨率高,可以分析不穩(wěn)定、不易衍生化、難揮發(fā)和分子量大的代謝物,可對(duì)極性化合物有較好的檢測(cè)。但數(shù)據(jù)庫(kù)不健全,可鑒定的化合物有限。

因此在選擇平臺(tái)時(shí)應(yīng)結(jié)合自身樣本情況與個(gè)體需求,綜合考慮。


11、色譜質(zhì)譜串聯(lián)的優(yōu)勢(shì)是什么?

使用靈敏度更高、分辨率更高、定性能力更強(qiáng)的質(zhì)譜儀代替了光學(xué)檢測(cè)器。將色譜的分離能力和質(zhì)譜的分辨、定性能力強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合,可以對(duì)更多的物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。


12、與16S聯(lián)用時(shí),代謝組檢測(cè)平臺(tái)一般選擇GC-MS,還是LC-MS?

兩種平臺(tái)都可以,因?yàn)闄z測(cè)平臺(tái)是依據(jù)檢測(cè)的代謝物類型來(lái)推薦的,具體參考如下圖:


13、能區(qū)分哪一個(gè)是寄主的代謝產(chǎn)物,哪個(gè)是哪種微生物的代謝產(chǎn)物嗎?

通過(guò)腸道菌群非靶向代謝組學(xué)的自建數(shù)據(jù)庫(kù),篩選出代謝物是微生物特有的,哪些是共有的,哪些是宿主的。

注:1166個(gè)腸道菌群特有的代謝物(其中884個(gè)有MS2譜圖),868個(gè)人菌共有的代謝物,366個(gè)人特有的代謝物,合計(jì)共2400個(gè)。


14、做了代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)沒有差異,該怎么辦?

如果沒有找到差異代謝物,那么還可以就檢測(cè)到的物質(zhì)進(jìn)行KEGG Patheway分析,即對(duì)代謝物參與的代謝通路進(jìn)行研究,觀察是否有其他的補(bǔ)給途徑、代謝途徑與疾病之間是否存在一定的關(guān)聯(lián)性。


15、代謝組檢測(cè)結(jié)果的物質(zhì)名稱都是英文的,我需要中文名稱怎么辦?

建議根據(jù)物質(zhì)的KEGG名稱和CAS號(hào)在“愛化學(xué)”(http://www.ichemistry.cn/)網(wǎng)站查詢中文名稱。


16、如何對(duì)差異代謝物做進(jìn)一步的篩選?

一般是使用 P值<0.05 & VIP>1這樣的卡值來(lái)進(jìn)行差異物的篩選。

P值來(lái)源單元變量統(tǒng)計(jì)分析,VIP值來(lái)源于多元變量統(tǒng)計(jì)分析(來(lái)源于 OPLS-DA模型)表征該變量對(duì)兩組差異的貢獻(xiàn)值,當(dāng)然VIP值越大對(duì)差異貢獻(xiàn)越大。

使用P值<0.05 & (FC>2或FC<0.5) [FC= Fold change]來(lái)進(jìn)行差異物篩選也是有這樣的做法,但是P值和FC值都來(lái)源單元變量統(tǒng)計(jì)分析。推薦使用P值<0.05 & VIP>1的篩選方法。

在此基礎(chǔ)上要做進(jìn)一步的篩選的話,有以下幾個(gè)方法:

1)P 值<0.05,對(duì)VIP值做排序(VIP值越大,差異代謝物越有意義)

2)VIP>1,對(duì) P值做排序(P值越小,差異代謝物越有意義)

3)在 P 值<0.05 & VIP>1 的范圍內(nèi),對(duì)FC值做排序(大于2的FC,越大越有意義;小于0.5的FC,越小越有意義)

限定更嚴(yán)格的基礎(chǔ)篩選條件,比如:P值<0.01 & VIP>2。重做以上三種方法。


高通量測(cè)序檢測(cè)中心


中心定位于科研服務(wù)與臨床醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化應(yīng)用,圍繞基礎(chǔ)科研和臨床檢測(cè)兩大板塊,致力于生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的相關(guān)研究與測(cè)序大數(shù)據(jù)聯(lián)合分析,為各大高校、醫(yī)院和科研單位提供醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目的方案設(shè)計(jì)、測(cè)序?qū)嶒?yàn)和數(shù)據(jù)分析為一體的一站式服務(wù)以及快速精準(zhǔn)的臨床檢測(cè)服務(wù),以成為業(yè)內(nèi)領(lǐng)先的高通量測(cè)序服務(wù)中心為目標(biāo)。


目前,我司高通量測(cè)序檢測(cè)中心擁有Illumina和MGI等高通量測(cè)序儀組成的大規(guī)模高通量測(cè)序服務(wù)平臺(tái),科研服務(wù)可提供涵蓋基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)(外泌體)、表觀組學(xué)、單細(xì)胞組學(xué)、微生物組學(xué)、免疫組庫(kù)、代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)和多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析等組學(xué)基礎(chǔ)研究服務(wù)和高級(jí)生物信息分析;臨床服務(wù)包括遺傳性腎病基因檢測(cè)、血液腫瘤基因檢測(cè)、實(shí)體瘤基因檢測(cè)、感染性疾病病原體檢測(cè)等服務(wù)。



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