2018-08-01
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為抵御各種各樣的病原體，人類(lèi)或哺乳動(dòng)物的適應性免疫系統擁有大量的T細胞受體(TCRs)和B細胞受體(BCRs)，統稱(chēng)為免疫組庫。高通量測序（NGS）技術(shù)允許對T或B細胞克隆進(jìn)行深入分析，能夠在檢測T或B細胞時(shí)提供前所未有的精細度。
該技術(shù)可以有效評估TCR或BCR互補決定區域(CDR3)的多樣性，并評估克隆類(lèi)型的構成：包括特定克隆類(lèi)型的比例；克隆之間的相似程度；V(D)J基因的使用頻率；核苷酸插入與缺失；CDR3區域長(cháng)度分布等信息。因此，免疫組庫高通量測序為評估健康或疾病狀態(tài)下的機體適應性免疫系統提供了可能。
高通量測序技術(shù)可快速便捷地對免疫組庫進(jìn)行全景式的掃描，但其涉及的PCR反應會(huì )導致假陽(yáng)性增加以及擴增偏倚，從而對數據結果的準確性造成潛在影響。
目前，現有的免疫組庫技術(shù)主要分為兩類(lèi)：
1.基于多重PCR的文庫構建方案：以DNA為模板，針對可變區（CDR3）設計多對引物，擴增出CDR3區段，再進(jìn)行文庫構建并測序；
2.基于5'RACE的文庫構建方案：以mRNA為模板，在恒定區設計引物逆轉錄擴出TCR或BCR的全長(cháng)序列，經(jīng)過(guò)兩輪PCR富集這一目的序列，再進(jìn)行文庫構建并測序。
但是，現有的基于多重PCR的文庫構建方案存在明顯不足之處：該方法同時(shí)進(jìn)行幾十種引物的擴增，體系異常復雜；多重引物設計需已知參考序列，不能充分捕捉到人類(lèi)等位基因突變序列；多種引物擴增效率可能存在偏倚，難以等效擴增；與使用mRNA構建文庫相比，DNA所需的PCR反應體系較大，樣本要求較高。
技術(shù)升級一：
廣州華銀健康科技有限公司推出全新的免疫組庫測序技術(shù)服務(wù)，基于5'RACE原理，并在原始模板擴增前引入UMI（Unique Molecular Indices，分子條形碼）進(jìn)行文庫構建：以恒定區單引物逆轉錄擴增出CDR區
域全長(cháng)序列的同時(shí)，引入UMI序列，可對后續PCR反應或測序過(guò)程中引入的錯誤進(jìn)行有效糾正，從而提高準確率。
技術(shù)升級二：
在逆轉錄環(huán)節，廣州華銀健康科技有限公司設計了針對微量樣品（低至100個(gè)細胞）的實(shí)驗流程：即通過(guò)oligo dT磁珠捕獲mRNA，以磁珠上的oligo dT為逆轉錄引物合成cDNA，并純化回收cDNA，較常規方法可大大提高效率，保證了人或小鼠來(lái)源的微量樣品的實(shí)驗成功率。
全新免疫組庫測序技術(shù)服務(wù)亮點(diǎn)
1.可滿(mǎn)足微量樣品建庫的實(shí)驗要求（最低可至100個(gè)細胞），兼容人以及小鼠樣本
微量RNA起始建庫流程圖
2.低RNA起始量的樣本也能快速達到測序飽和期，相同RNA起始量下的樣本其相關(guān)度較高
同一樣本RNA起始量不同時(shí)到達測序飽和期數據統計曲線(xiàn)圖
同一樣本RNA起始量相同時(shí)樣本間的相關(guān)性圖
（A1/A2/A3為起始RNA量為1600ng; B1/B2/B3為起始量為400ng; C1/C2/C3為起始量為50ng）
3.基于強大的UMI標記與校正算法，可有效糾正PCR與測序過(guò)程引入的錯誤與偏倚，極大地提高準確度
經(jīng)過(guò)UMI算法校正后的部分測試數據統計表
4.對測序下機數據進(jìn)行多維度分析，給出最全面的數據結果報告，并可定制個(gè)性化分析服務(wù)
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