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16S+代謝組學(xué)聯(lián)用常見(jiàn)問(wèn)題一攬子告訴你答案

2023-01-12 閱讀數:4540





微生物16S分析鑒定了樣本中微生物的種類(lèi)和可能具有的功能,但是微生物真的有這樣的功能嗎?怎么能快速準確地做出鑒定呢?那就來(lái)試試16S+代謝組學(xué)聯(lián)用的方法吧。


組學(xué)聯(lián)用,一個(gè)鑒定微生物種類(lèi),一個(gè)鑒定微生物功能,還能發(fā)高分文章,why not?


1、16S是什么?

16S rDNA是指細菌基因組中編碼核糖體16S rRNA分子所對應的DNA序列,序列全長(cháng)約1540bp,包含10個(gè)保守區和9個(gè)高變區(V1-V9)。保守區序列在細菌間差異不大而高變區則具有種屬特異性,因此最常用作細菌分類(lèi)標準。通過(guò)對環(huán)境樣品的細菌總DNA進(jìn)行提取,擴增其中16S rDNA基因,可以鑒定出絕大多數細菌類(lèi)別。


2、代謝組學(xué)是什么?

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的新興的組學(xué)技術(shù),是系統生物學(xué)的組成部分。其對生物體內所有小分子代謝物進(jìn)行定性定量分析,并尋找代謝物與生理病理變化的相對關(guān)系的研究方式,其研究對象大都是分子量1500以?xún)鹊男》肿游镔|(zhì)。


3、為什么要選擇做16S+代謝組學(xué)?

16S只是研究了腸道微生物的構成和組份的改變與宿主的生理以及人類(lèi)的疾病相關(guān)。然而,腸道微生物對宿主的作用其中一方面貢獻是通過(guò)腸道中微生物產(chǎn)生的小分子次級代謝產(chǎn)物,通過(guò)循環(huán)系統來(lái)作用于人體的各個(gè)部位,調控宿主體內的穩態(tài),比如許多研究發(fā)現,腸道微生物的代謝產(chǎn)物對糖尿病、高血壓、心臟病和抑郁、腸道的免疫等疾病都有影響。16S可以得到樣本當中有哪些微生物,和預測他們的功能,而代謝組學(xué)研究代謝物的表達量、代謝物與生理病理變化的關(guān)系,能夠幫助確定這些功能是否真的發(fā)生了,發(fā)生的程度是什么樣的。兩者的聯(lián)用,可以通過(guò)代謝組結果的檢測輔助和驗證16S分析結果;兩者的聯(lián)合分析可以得到微生物多樣性、種類(lèi)、相對豐度與代謝物豐度的關(guān)聯(lián)。


4、代謝組學(xué)與其他組學(xué)相比,有什么優(yōu)勢?

①基因和蛋白質(zhì)表達的微小變化會(huì )在代謝物水平得到放大;

②代謝組學(xué)的研究不需進(jìn)行全基因組測序及建立大量表達序列標簽的數據庫;

③代謝物種類(lèi)遠少于基因和蛋白的數目,每個(gè)生物體中代謝產(chǎn)物大約在103數量級,而最小的細菌,其基因組中也有幾千個(gè)基因;

④生物體液的代謝物分析可反映機體系統的生理和病理狀態(tài)。


5、與16S聯(lián)用時(shí),如何選擇是用非靶標代謝組還是高通量靶標代謝組?

如果沒(méi)有特別關(guān)注的代謝物質(zhì)建議選擇非靶標,可以檢測出某一特定條件下所有的代謝產(chǎn)物,并進(jìn)行定性和相對定量分析,以尋找目標差異代謝物;如果有關(guān)注的目標代謝物建議選擇高通量靶標代謝組,對特定的代謝物群進(jìn)行有針對性的特異性檢測。


6、16S 與代謝組聯(lián)用時(shí),一般檢測哪些樣品類(lèi)型?樣本量需要多少?

代謝組與16S聯(lián)用時(shí),16S的樣品主要是糞便和腸道內容物;而代謝組的樣本主要是糞便、血漿或血清、尿液等(具體項目可以參考相應的參考文獻)。

臨床標本:每組100例(不少于30例,越多越好)

模式動(dòng)物:每組12個(gè)樣品(不少于8個(gè),越多越好)

注意:遵從“保持最鮮活的狀態(tài)”原則,通過(guò)低溫、淬滅的方法阻止離體后的代謝活動(dòng)。樣品不能pooling,不能反復凍融;血清/血漿不能溶血;如果是用血漿,請用肝素鈉抗凝,EDTA抗凝效果不好。


7、代謝組為什么需要這么多生物學(xué)重復?

相較于基因和蛋白,代謝物處于生命活動(dòng)的下游,動(dòng)態(tài)波動(dòng)性大。因此需要很多生物學(xué)重復來(lái)增加數據的可靠性和說(shuō)服力。


8、代謝組和16S的樣品取樣時(shí)間可以不一致?

建議取樣時(shí)間一致。

若代謝組和16S樣本類(lèi)型一樣,那么在收集樣品的時(shí)候可以多準備一份樣品,即一個(gè)樣分裝至少2兩管,一管用于16S,一管用于代謝組。

若代謝組和16S樣本類(lèi)型不一樣,也應該要保持一樣的取樣時(shí)間。


9、同一樣本的代謝組為什么不能分兩批檢測?

最好不要分成兩批檢測,因為這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)儀器的響應會(huì )發(fā)生變化,這樣可能導致的問(wèn)題是一些含量低的物質(zhì)可能只在一個(gè)批次里被檢出。


10、代謝組學(xué)我該選擇哪個(gè)平臺?

代謝組學(xué)的技術(shù)平臺主要分為NMR(核磁共振譜)、GC-MS(氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)、LC-MS(液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)。

NMR的特點(diǎn)是樣品需求量小,前處理比較簡(jiǎn)單,對于復雜的生物樣本比較合適;但對讀譜人員的要求高;靈敏度低,檢測動(dòng)態(tài)范圍有限。

GC-MS和LC-MS的特點(diǎn)是結合了色譜良好的分離能力和質(zhì)譜的普適性、高靈敏度以及專(zhuān)一性,具體而言GC-MS分辨率、選擇性好,數據庫較為健全,但樣品處理過(guò)程繁瑣;LC-MS靈敏度、分辨率高,可以分析不穩定、不易衍生化、難揮發(fā)和分子量大的代謝物,可對極性化合物有較好的檢測。但數據庫不健全,可鑒定的化合物有限。

因此在選擇平臺時(shí)應結合自身樣本情況與個(gè)體需求,綜合考慮。


11、色譜質(zhì)譜串聯(lián)的優(yōu)勢是什么?

使用靈敏度更高、分辨率更高、定性能力更強的質(zhì)譜儀代替了光學(xué)檢測器。將色譜的分離能力和質(zhì)譜的分辨、定性能力強強聯(lián)合,可以對更多的物質(zhì)進(jìn)行準確檢測。


12、與16S聯(lián)用時(shí),代謝組檢測平臺一般選擇GC-MS,還是LC-MS?

兩種平臺都可以,因為檢測平臺是依據檢測的代謝物類(lèi)型來(lái)推薦的,具體參考如下圖:


13、能區分哪一個(gè)是寄主的代謝產(chǎn)物,哪個(gè)是哪種微生物的代謝產(chǎn)物嗎?

通過(guò)腸道菌群非靶向代謝組學(xué)的自建數據庫,篩選出代謝物是微生物特有的,哪些是共有的,哪些是宿主的。

注:1166個(gè)腸道菌群特有的代謝物(其中884個(gè)有MS2譜圖),868個(gè)人菌共有的代謝物,366個(gè)人特有的代謝物,合計共2400個(gè)。


14、做了代謝組學(xué)發(fā)現沒(méi)有差異,該怎么辦?

如果沒(méi)有找到差異代謝物,那么還可以就檢測到的物質(zhì)進(jìn)行KEGG Patheway分析,即對代謝物參與的代謝通路進(jìn)行研究,觀(guān)察是否有其他的補給途徑、代謝途徑與疾病之間是否存在一定的關(guān)聯(lián)性。


15、代謝組檢測結果的物質(zhì)名稱(chēng)都是英文的,我需要中文名稱(chēng)怎么辦?

建議根據物質(zhì)的KEGG名稱(chēng)和CAS號在“愛(ài)化學(xué)”(http://www.ichemistry.cn/)網(wǎng)站查詢(xún)中文名稱(chēng)。


16、如何對差異代謝物做進(jìn)一步的篩選?

一般是使用 P值<0.05 & VIP>1這樣的卡值來(lái)進(jìn)行差異物的篩選。

P值來(lái)源單元變量統計分析,VIP值來(lái)源于多元變量統計分析(來(lái)源于 OPLS-DA模型)表征該變量對兩組差異的貢獻值,當然VIP值越大對差異貢獻越大。

使用P值<0.05 & (FC>2或FC<0.5) [FC= Fold change]來(lái)進(jìn)行差異物篩選也是有這樣的做法,但是P值和FC值都來(lái)源單元變量統計分析。推薦使用P值<0.05 & VIP>1的篩選方法。

在此基礎上要做進(jìn)一步的篩選的話(huà),有以下幾個(gè)方法:

1)P 值<0.05,對VIP值做排序(VIP值越大,差異代謝物越有意義)

2)VIP>1,對 P值做排序(P值越小,差異代謝物越有意義)

3)在 P 值<0.05 & VIP>1 的范圍內,對FC值做排序(大于2的FC,越大越有意義;小于0.5的FC,越小越有意義)

限定更嚴格的基礎篩選條件,比如:P值<0.01 & VIP>2。重做以上三種方法。


高通量測序檢測中心


中心定位于科研服務(wù)與臨床醫學(xué)轉化應用,圍繞基礎科研和臨床檢測兩大板塊,致力于生物醫學(xué)各領(lǐng)域的相關(guān)研究與測序大數據聯(lián)合分析,為各大高校、醫院和科研單位提供醫學(xué)科研項目的方案設計、測序實(shí)驗和數據分析為一體的一站式服務(wù)以及快速精準的臨床檢測服務(wù),以成為業(yè)內領(lǐng)先的高通量測序服務(wù)中心為目標。


目前,我司高通量測序檢測中心擁有Illumina和MGI等高通量測序儀組成的大規模高通量測序服務(wù)平臺,科研服務(wù)可提供涵蓋基因組學(xué)、轉錄組學(xué)(外泌體)、表觀(guān)組學(xué)、單細胞組學(xué)、微生物組學(xué)、免疫組庫、代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)和多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析等組學(xué)基礎研究服務(wù)和高級生物信息分析;臨床服務(wù)包括遺傳性腎病基因檢測、血液腫瘤基因檢測、實(shí)體瘤基因檢測、感染性疾病病原體檢測等服務(wù)。



如需了解更多有關(guān)高通量測序相關(guān)信息,歡迎撥打我司高通量全國服務(wù)熱線(xiàn):020-38917402、020-38917464

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